山莨菪堿對電離輻射致耳蝸損傷防護(hù)作用的電鏡觀察

金大玉 印有亮

山莨菪堿作為毒蕈堿型(M型)乙酰膽堿受體競爭性阻斷劑除M受體阻斷作用外尚有許多其他重要的治療作用，它可通過多種途徑調(diào)節(jié)微循環(huán)和發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于治療休克、心血管系統(tǒng)疾病、糖尿病、血液系統(tǒng)疾病等，但是山莨菪堿在治療內(nèi)耳疾病方面的研究不多，僅有一些關(guān)于噪聲性聾[1,2]、梅尼埃病和突發(fā)性聾等疾病的臨床應(yīng)用報道，在對耳蝸輻射損傷保護(hù)作用方面尚未見文獻(xiàn)報道。因此，本研究旨在通過電鏡觀察應(yīng)用山莨菪堿后豚鼠耳顳部電離輻射后耳蝸毛細(xì)胞的形態(tài)變化，探討山莨菪堿對耳蝸放射損傷的保護(hù)作用，并初步探討其機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組 采用耳廓反應(yīng)靈敏的健康豚鼠25只，隨機分成3組：正常對照組5只，觀察雙耳共10耳；單放組10只，觀察左耳共10耳；防護(hù)組10只，觀察左耳共10耳。每次放射前30分鐘，防護(hù)組按20 mg/kg體重股部肌肉注射山莨菪堿，對照組和單放組注射等量生理鹽水。

1.2電離輻射方法 單放組及防護(hù)組豚鼠不麻醉，用熱塑面膜固定，專用X線模擬定位機定位；暴露頭部，用醫(yī)用直線加速器所產(chǎn)生的6 MeV電子線進(jìn)行分次照射，每次2 Gy,每周5次，共30次，累計劑量60 Gy。對照組不預(yù)照射。

1.3掃描電鏡標(biāo)本制備及觀察 各組選擇8耳，進(jìn)行2.5%戊二醛活體心臟灌注，灌流固定后，去除前庭膜，盡可能地暴露螺旋器。在解剖顯微鏡下定位，將要觀察的部分面朝上，用導(dǎo)電膠固定在樣品臺上。然后進(jìn)行鍍膜，隨即在日立S—450型掃描電鏡下觀察耳蝸毛細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化并拍照。

1.4透射電鏡標(biāo)本制備及觀察 各組隨機選擇2耳，進(jìn)行2.5%戊二醛活體心臟灌注，灌流固定后，在解剖顯微鏡下取出基底膜，繼續(xù)進(jìn)行梯度乙醇脫水、浸透、包埋、聚合、修塊、切半薄切片、染色定位、制刀和制備水槽、制備支持膜網(wǎng)、超薄切片、染色過程后，最后用透射電鏡進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

2.1一般狀態(tài)觀察 各組豚鼠在放射中及放射后均無頭部偏斜及行走時傾倒趨勢，飲食可，無明顯消瘦，無死亡。

2.2透射電鏡觀察結(jié)果 正常對照組耳蝸外毛細(xì)胞邊界清楚，細(xì)胞無腫脹，表皮板完整，線粒體嵴完整，核膜完整(圖1)。單放組耳蝸的外毛細(xì)胞邊界不清，細(xì)胞腫脹變形；表皮板疏松、不規(guī)則、局部變??；線粒體空泡變，線粒體嵴斷裂；胞漿內(nèi)可見許多無結(jié)構(gòu)區(qū)；核膜不完整，異染色質(zhì)增多(圖2)。防護(hù)組耳蝸外毛細(xì)胞邊界較清，細(xì)胞略腫脹；表皮板完整，線粒體嵴較完整，核膜較完整(圖3)。

2.3掃描電鏡觀察結(jié)果 對照組耳蝸外毛細(xì)胞靜纖毛排列呈V字形，纖毛排列整齊，靜纖毛僵直度正常(圖4)。單放組耳蝸外毛細(xì)胞靜纖毛排列失去其正常的V字形，纖毛明顯融合、倒伏、缺失、排列紊亂，表皮板軟化、塌陷(圖5)。防護(hù)組耳蝸外毛細(xì)胞靜纖毛僵直度正常，排列基本整齊，偶見倒伏現(xiàn)象(圖6)。

圖1 對照組透射電鏡觀察 外毛細(xì)胞邊界清楚,細(xì)胞無腫脹;表皮板完整;線粒體嵴完整;核膜完整(×2 000倍) 圖2 單放組透射電鏡觀察 外毛細(xì)胞邊界不清,細(xì)胞腫脹變形;表皮板疏松、不規(guī)則、局部變薄;線粒體空泡變,線粒體嵴斷裂;胞漿內(nèi)可見許多無結(jié)構(gòu)區(qū);核膜不完整,異染色質(zhì)增多(×2 000倍) 圖3 防護(hù)組透射電鏡觀察 外毛細(xì)胞邊界較清,細(xì)胞略腫脹;表皮板完整;線粒體嵴較完整;核膜較完整(×2 000倍)

圖4 對照組掃描電鏡 外毛細(xì)胞靜纖毛排列呈V字形,纖毛排列整齊,靜纖毛僵直度正常(×2 000倍) 圖5 單放組掃描電鏡 外毛細(xì)胞靜纖毛排列失去正常的V字形,纖毛明顯融合、倒伏、缺失、排列紊亂,表皮板軟化、塌陷(×2 000倍) 圖6 防護(hù)組掃描電鏡 外毛細(xì)胞靜纖毛僵直度正常,排列基本整齊,偶見倒伏現(xiàn)象(×2 000倍)

3 討論

山莨菪堿對耳蝸輻射損傷防護(hù)的機制可能與其通過多種途徑調(diào)節(jié)內(nèi)耳微循環(huán)及其細(xì)胞保護(hù)作用有關(guān)。電離輻射對耳蝸的損傷，一方面是直接作用于感覺細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞膜、線粒體膜、溶酶體膜等，發(fā)生脂質(zhì)過氧化從而產(chǎn)生一系列的自由基反應(yīng)，損傷毛細(xì)胞。對山莨菪堿抗氧化機理的研究發(fā)現(xiàn)，它對次黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶體系中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基有顯著劑量依賴性清除作用[3]，因此可通過抗氧化作用減少自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而發(fā)揮保護(hù)內(nèi)耳毛細(xì)胞的作用。電離輻射對耳蝸損傷的另一機制可能是輻射引起血管紋及其中微小血管的損傷[4]，導(dǎo)致血-迷路屏障的形態(tài)結(jié)構(gòu)損害[5]，而造成內(nèi)耳微循環(huán)障礙。山莨菪堿可抑制血栓烷A2的合成，抑制血小板及粒細(xì)胞的聚集，增強微血管的自律運動，使微血管血流速度加快和血流量增加；實驗證明它可以明顯降低紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化物的量，增加紅細(xì)胞膜的流動性，使紅細(xì)胞的變形能力增強，從而改善血流變學(xué)的特性[6]；山莨菪堿除可通過神經(jīng)調(diào)節(jié)阻斷M受體對抗兒茶酚胺引起的血管痙攣外，還可通過促進(jìn)一氧化氮合酶活性，催化L精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐谎趸?，后者彌散或載體轉(zhuǎn)運至血管平滑肌，激活胞酶，使內(nèi)鳥苷酸環(huán)化cGMP升高而擴張血管[7]。山莨菪堿通過上述多種途徑，改善內(nèi)耳微循環(huán)，從而發(fā)揮其對內(nèi)耳輻射損傷的保護(hù)作用。本實驗掃描電鏡和透射電鏡觀察結(jié)果示，單放組耳蝸外毛細(xì)胞失去正常結(jié)構(gòu)，而放射前注射山莨菪堿的防護(hù)組耳蝸外毛細(xì)胞基本正常，證實山莨菪堿對耳蝸外毛細(xì)胞具有明顯的防護(hù)作用。