響應(yīng)面優(yōu)化西蘭花莖硫苷提取及其抗氧化性研究

（長(zhǎng)沙商貿(mào)旅游職業(yè)技術(shù)學(xué)院湘菜學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410116）

西蘭花（Brassica oleracea L.var.Italic Planch）又名綠花菜、花椰菜、青花菜等，屬十字花科蕓苔屬甘藍(lán)種的一個(gè)變種。流行病學(xué)研究表明，隨著十字花科蔬菜食用量的增加，多種癌癥的發(fā)生率隨之降低，其中以西蘭花和卷心菜最為顯著。Verhoeven等[1]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)70%的癌癥與十字花科蔬菜的攝入量呈負(fù)相關(guān)。食用十字花科蔬菜能降低人類前列腺癌、肺癌、食道癌、膀胱癌和結(jié)腸癌等患病風(fēng)險(xiǎn)[2-3]。多項(xiàng)研究表明十字花科蔬菜及其某些成分具有抗癌作用，其中包括硫代葡萄糖苷（簡(jiǎn)稱硫苷glucosinolates，GS）、吲哚類、吡噻硫酮等。而西蘭花種苗中硫代葡萄糖苷類含量十分豐富，其對(duì)健康促進(jìn)作用通常主要?dú)w功于其次生代謝產(chǎn)物水解產(chǎn)生的異硫氰酸酯（isothiocyanate，ITCs），完整的硫代葡萄糖苷幾乎沒有抗癌活性，只有在水解成異硫氰酸酯后才能發(fā)揮其重要的抗癌防癌作用[4]。

西蘭花是十字花科主要的作物之一，然而在生產(chǎn)鏈的不同階段產(chǎn)生了大量西蘭花邊角廢料和副產(chǎn)品，產(chǎn)生的副產(chǎn)物葉和莖大約占西蘭花的總重量的40%～50%左右[5-7]。目前，關(guān)于直接通過(guò)酶解西蘭花或從油菜籽等中提取ITCs的國(guó)內(nèi)外研究比較多[8-9]，而關(guān)于從西蘭花莖中提取GS的研究報(bào)道比較少[10-11]；GS在內(nèi)源性芥子酶等作用下水解成ITCs產(chǎn)生刺激性氣味，盡管ITCs具有很好的抗癌等功能，但其不愉快的氣味對(duì)產(chǎn)品感官產(chǎn)生很大負(fù)面影響，直接添加在產(chǎn)品中ITCs成分消費(fèi)者難以接受[12]；然而研究表明人體的腸道菌群能夠水解GS產(chǎn)生ITCs，從而避免了直接添加ITCs造成產(chǎn)品感官的缺陷[13-14]。

本試驗(yàn)以西蘭花莖為原料，通過(guò)超聲波輔助提取GS[15]，采用氯化鈀分光光度法測(cè)定硫苷的含量，通過(guò)單因素研究超聲功率、提取時(shí)間、物料粒徑、料液比以及磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）濃度等因素對(duì)GS的提取率的影響，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以硫苷提取量為響應(yīng)指標(biāo)，采用四因素三水平響應(yīng)面分析方法確定GS的最優(yōu)提取工藝條件；以市售蘋果汁為載體測(cè)定粗提硫苷的體外抗氧化活性，以期為西蘭花綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料和設(shè)備

1.1 試驗(yàn)材料和試劑

新鮮西蘭花副產(chǎn)物（莖）、蘋果汁：市售；鹽酸、氯化鈀、乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（分析純）：南京化工廠。

1.2 試驗(yàn)儀器

HH恒溫水浴鍋：金壇市中大儀器廠；VGT-1860QTD單槽超聲波清洗機(jī)：廣東固特超聲股份有限公司；FA2004N電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；TG16臺(tái)式離心機(jī)：長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司；TYL-2AB不銹鋼電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津天有利科技有限公司。

2 方法

2.1 預(yù)處理

將新鮮的西蘭花莖洗凈，用刀切成薄片（0.1 cm～0.3 cm）后迅速在90℃熱燙5 min進(jìn)行滅酶處理。將滅酶后得西蘭花薄片在60℃下恒溫干燥后粉碎過(guò)60目篩得到西蘭花莖粉末（broccoli stems powder，BSP）備用。

2.2 西蘭花莖中提取硫苷的單因素試驗(yàn)

選擇超聲提取時(shí)間、超聲提取功率、超聲提取溫度、料液比以及PBS濃度為研究變量，考察超聲提取時(shí)間、超聲提取功率、超聲提取溫度、料液比以及PBS濃度對(duì)西蘭花莖硫苷提取產(chǎn)率的影響。

2.3 響應(yīng)面分析試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取超聲功率、超聲時(shí)間、提取溫度和料液比4個(gè)影響最為顯著的因素為自變量，采用四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experimental design and variables levels for Box-Behnken

2.4 西蘭花莖硫苷的測(cè)定方法

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用氯化鈀分光光度法測(cè)定硫苷的含量[16]，測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線：

式中：y為待測(cè)液在 540 nm 處的吸光度（A540）；x為待測(cè)液的硫苷含量，mg/mL。

硫甙含量與A540呈線性正相關(guān)，因此本試驗(yàn)用A540表示提取液中硫甙含量。

2.4.2 樣品硫苷含量測(cè)定

取上清濾液1 mL置于試管中，加入2 mL0.15%CMC-Na溶液搖勻后，加入1 mL8 mmol/L氯化鈀顯色液充分搖勻，在25℃下恒溫放置2小時(shí)后在540 nm下測(cè)定吸光度。

2.5 西蘭花莖硫苷的抗氧化能力測(cè)定

根據(jù)Biegańskamarecik等[17]ABTS法測(cè)定自由基清除活性。將0.007 mol/L ABTS溶液與0.002 mol/L過(guò)硫酸鉀溶液以1∶0.5（體積比）混合在室溫下避光放置12 h～16 h。測(cè)定前，將ABTS溶液用pH7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋直到 ABTS 溶液達(dá)到 0.700（±0.020）的吸光度。將提取上清液（50 μL）與5 mL稀釋的ABTS溶液混合，37℃下反應(yīng)5分鐘后在734 nm測(cè)定其吸光度A734，以PBS緩沖液用作空白。平行測(cè)定3次，根據(jù)以下公式算ABTS+·的清除率，結(jié)果用μmol/mL Trolox相對(duì)值表示。

式中：A為樣品吸光值；A0為空白吸光值。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 超聲功率對(duì)硫苷提取量的影響

超聲功率對(duì)硫苷提取量的影響見圖1。

圖1 超聲功率對(duì)硫苷提取的影響Fig.1 The effect of ultrasonic power on the extraction volume of GS

由圖1可知，超聲功率由30 W升到90 W過(guò)程中，硫苷含量不斷增大，在90 W時(shí)吸光值達(dá)到最大，為0.650（GS含量為0.641 mg/mL），當(dāng)超聲功率繼續(xù)增大時(shí)，硫苷含量開始下降，原因是超聲功率的增大使得硫苷水解成ITCs等物質(zhì)[18]；由于在60 W和90 W測(cè)得的吸光度值無(wú)顯著差異（n=3，p＞0.05），考慮節(jié)約能源與工業(yè)化生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)可行性等因素條件下選取最佳超聲功率為60 W。

3.1.2 超聲時(shí)間對(duì)硫苷提取量的影響

超聲時(shí)間對(duì)硫苷提取量的影響見圖2。

由圖2可知，超聲時(shí)間由10 min到20 min過(guò)程中，硫苷含量不斷增大，在20 min時(shí)吸光值達(dá)到最大，為0.602（GS含量為0.589 2 mg/mL），當(dāng)進(jìn)一步延長(zhǎng)超聲時(shí)間，硫苷含量開始下降，這是由于超聲作用有助于硫苷水解成ITCs[18]。因此選擇最佳超聲時(shí)間為20 min。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)硫苷提取的影響Fig.2 The effect of ultrasonic time on the extraction volume of GS

3.1.3 提取溫度對(duì)硫苷提取量的影響

提取溫度對(duì)硫苷提取量的影響見圖3。

圖3 提取溫度對(duì)硫苷提取的影響Fig.3 The effect of extraction temperaure on the extraction volume of GS

由圖3可知，當(dāng)提取溫度由20℃升到60℃時(shí)，硫苷含量先升后降，在40℃時(shí)吸光值達(dá)到最大，為0.632（GS含量為0.622 mg/mL），當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，硫苷含量開始下降，這是由于硫苷受熱不穩(wěn)定，高溫下易水解成ITCs等物質(zhì)[19]；試驗(yàn)結(jié)果表明低溫條件下有利于硫苷的穩(wěn)定存在，因此，選取最佳提取溫度為40℃。

3.1.4 料液比對(duì)硫苷提取量的影響

料液比對(duì)硫苷提取量的影響見圖4。

由圖4可知，當(dāng)料液比逐漸增大時(shí)，硫苷含量先增大后趨于水平，當(dāng)料液比由1∶5（g/mL）增大到1∶15（g/mL）時(shí)，吸光值逐漸升高，硫苷充分溶出；當(dāng)料液比由 1∶15（g/mL）增大到 1∶25（g/mL）時(shí)，吸光值趨于水平，這是由于硫苷溶出率趨于飽和。當(dāng)料液比為1∶20（g/mL）時(shí)，吸光值達(dá)到最大，為0.567（GS含量為 0.506 mg/mL），由于料液比為 1∶15（g/mL）和1∶20（g/mL）的吸光值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性（p＞0.05），因此，選取最佳料液比為1∶15（g/mL）。

圖4 料液比對(duì)硫苷提取的影響Fig.4 The effect of solid-liquid ratio on the extraction volume of GS

3.1.5 PBS濃度對(duì)硫苷提取量的影響

PBS濃度對(duì)硫苷提取量的影響見圖5。

圖5 PBS濃度對(duì)硫苷提取的影響Fig.5 The effect of PBS buffer concentration on the extraction volume of GS

由圖5可知，當(dāng)PBS濃度逐漸增大時(shí)，硫苷含量先增大后逐漸減小，當(dāng)PBS濃度為0.6 mol/L時(shí)，吸光值達(dá)到最大，為0.612（GS含量為0.600 mg/mL）。由于0.4 mol/L和0.6 mol/L的吸光值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性（p＞0.05），因此，考慮節(jié)約能源與工業(yè)化生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)可行性等因素條件下選取最佳PBS濃度為0.4 mol/L。

3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化硫苷提取工藝

采用Design-Expert 8.0.6對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，擬合二次多項(xiàng)式方程，用R2表示擬合度；采用F檢驗(yàn)對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析以評(píng)價(jià)模型的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.2.1 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合最小顯著性差異分析，選取超聲時(shí)間、超聲功率、提取溫度和料液比4個(gè)條件作為主要因素，以硫苷濃度（mg/mL）為響應(yīng)值。依據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果Table 2 Box-Behnken design matrix and the experimental result

3.2.2 模型建立及方差分析

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6對(duì)表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得到以硫苷含量（Y）為響應(yīng)值的擬合方程：

回歸方程的方差分析結(jié)果見表3。

由表3可知，超聲時(shí)間（A）、超聲功率（B）、提取溫度（C）、超聲時(shí)間和超聲功率的交互項(xiàng)（AB）、超聲時(shí)間二次項(xiàng)（A2）、超聲功率二次項(xiàng)（B2）、提取溫度二次項(xiàng)（C2）和料液比二次項(xiàng)（D2）達(dá)到極顯著水平（p＜0.01）；超聲時(shí)間和提取溫度交互項(xiàng)（AC）與提取溫度和料液比交互項(xiàng)（CD）達(dá)到顯著水平（p＜0.05）。這說(shuō)明選取的試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，還能看出各因素對(duì)硫苷含量的影響大小順序：C＞B＞A＞D。

表3 響應(yīng)面二次回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for response surface quadratic regression equation

圖6 超聲功率和超聲時(shí)間交互作用影響硫苷提取量的曲面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of variables on the extraction volume of GS versus ultrasonic power and ultrasonic treatment time

該模型的 R2值為 0.977 6（p＜0.01），虛擬項(xiàng)不顯著（p=0.070 8），說(shuō)明通過(guò)二次回歸得到的硫苷含量模型與試驗(yàn)擬合度良好、誤差??；模型的校正系數(shù)RAdj2=0.955 2，表明此回歸模型可以解釋95.52%響應(yīng)值變化，說(shuō)明此法可靠、具有可行性。

通過(guò)軟件分析得出最佳提取條件為：超聲時(shí)間22.42 min、超聲功率79.59 W、提取溫度37.96℃、料液比1∶16.56（g/mL），在此條件下硫苷提取量的預(yù)測(cè)值為0.740 mg/mL?；诠I(yè)化實(shí)際可操作性等因素考慮，將最佳提工藝條件調(diào)整為：超聲時(shí)間22 min、超聲功率80W、提取溫度 40℃、料液比 1∶16（g/mL），在此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，提取的硫苷含量為0.732 mg/mL，與理論值相對(duì)誤差為1.1%，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果與模型符合良好。

3.2.3 因子交互作用分析

應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件分析因素交互作用響應(yīng)面及等高線圖（見圖6～圖11），通過(guò)該組動(dòng)態(tài)圖即可對(duì)任何兩個(gè)因素交互影響提取西蘭花莖硫苷含量的效應(yīng)進(jìn)行分析與評(píng)價(jià)。所擬合的響應(yīng)曲面和等高線圖能較直觀地反映各因素間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，其中等高線呈圓形說(shuō)明兩個(gè)因素交互作用不顯著，等高線呈橢圓說(shuō)明兩個(gè)因素交互作用顯著。

圖8 料液比和超聲時(shí)間交互作用影響硫苷提取量的曲面圖和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots for the effect of variables on the extraction volume of GS versus solid-liquid ratio and ultrasonic treatment time

圖9 提取溫度和超聲功率交互作用影響硫苷提取量的曲面圖和等高線圖Fig.9 Response surface and contour plots for the effect of variables on the extraction volume of GS versus ultrasonic power and extraction temperature

圖10 超聲功率和料液比交互作用影響硫苷提取量的曲面圖和等高線圖Fig.10 Response surface and contour plots for the effect of variables on the extraction volume of GS versus ultrasonic power and solid-liquid ratio

圖11 提取溫度和料液比交互作用影響硫苷提取量的曲面圖和等高線圖Fig.11 Response surface and contour plots for the effect of variables on the extraction volume of GS versus extraction temperature and solid-liquid ratio

由圖6～圖11可以看出，每個(gè)響應(yīng)曲面均為開口向下的凸形曲面，每個(gè)響應(yīng)面都有極高值，出現(xiàn)在等高線的圓心處。其中超聲時(shí)間（A）和料液比（D）的等高線圖與圓形最接近，說(shuō)明他們之間的交互作用對(duì)硫苷含量提取的影響最小，其次是超聲功率（B）和超聲溫度（C）、超聲功率（B）和料液比（D）。而等高線越扁平則表示兩因素的交互作用越大，超聲時(shí)間（A）和超聲功率（B）的交互作用對(duì)硫苷提取量的影響作用最大。

3.3 西蘭花莖硫苷的抗氧化結(jié)果分析

以最優(yōu)工藝組合對(duì)西蘭花莖進(jìn)行提取，以100 mL市售蘋果汁為載體，蘋果汁添加西蘭花莖提取物的抗氧化結(jié)果見表4。

表4 西蘭花莖提取物的抗氧化結(jié)果（n=5，平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）Table 4 The antioxidant activity result of extracts from broccoli stems（n=5，average value ± standard deviation）

西蘭花莖提取物抗氧化結(jié)果見表4，與原蘋果汁抗氧化能力4.08 μmol Trolox/mL相比，通過(guò)添加西蘭花莖提取物能顯著提高蘋果汁的抗氧化能力（p＜0.05）；添加西蘭花莖提取原液使得蘋果汁的抗氧化能力提升62.99%，而添加西蘭花莖提取液的凍干物使得蘋果汁的抗氧化能力提升了124.51%。

4 結(jié)論

本研究對(duì)超聲輔助提取西蘭花莖中硫代葡萄糖苷的各個(gè)相關(guān)因素進(jìn)行了研究，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)超聲輔助法提取西蘭花莖中硫代葡萄糖苷的提取條件進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化，并通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)得到了最佳超聲輔助提取西蘭花莖中硫代葡萄糖苷的工藝條件，即超聲時(shí)間22 min、超聲功率80 W、提取溫度40℃、料液比1∶16（g/mL），從西蘭花莖中提取的硫苷總含量為0.732 mg/mL。在現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)上，初步探討了與硫代葡萄糖苷相關(guān)的4個(gè)不同因素對(duì)硫苷提取量的影響，對(duì)提取物的抗氧化性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在添加提取原液和凍干物兩種形式的西蘭花莖提取物，抗氧化值由原來(lái)的4.08 μmol Trolox/mL分別提高到6.65 μmol Trolox/mL 和 9.16 μmol Trolox/mL，平均提高了2倍～3倍，并達(dá)到了預(yù)期效果，試驗(yàn)結(jié)果為從天然材料中提取硫代葡萄糖苷的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。