同位素內(nèi)標(biāo)法測定雞蛋中金剛烷胺殘留

楊修鎮(zhèn) 張呈軍 劉少寧 陳玲 牛華星 尹伶靈

（山東省獸藥質(zhì)量檢驗所 山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測與風(fēng)險評估重點實驗室 山東 濟南 250022）

金剛烷胺是用于抑制人類流感病毒的藥物，它可以抑制病毒穿入宿主細(xì)胞，并影響病毒的脫殼[1]，被列為流感防治國家儲備藥品。在畜牧養(yǎng)殖上金剛烷胺曾主要用于雞禽流感的預(yù)防和早期治療[2]，由于其移植獸用后缺乏有效的動物安全試驗數(shù)據(jù)，人食用帶有金剛烷胺殘留的動物產(chǎn)品后易產(chǎn)生具有良好遺傳特性可在人與人之間傳播的耐藥流感毒株[3]，我國農(nóng)業(yè)部2005年發(fā)布560號公告明令禁止金剛烷胺等抗病毒藥物用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)[4]。我國目前沒有抗病毒藥物替代產(chǎn)品，違規(guī)使用金剛烷胺的現(xiàn)象仍偶有發(fā)生，本文在總結(jié)前人工作的基礎(chǔ)上，采用同位素內(nèi)標(biāo)法對雞蛋中金剛烷胺殘留檢測方法進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

Waters Xevo TQ-S高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜儀、電子天平(感量0.01g、0.00001g)、均質(zhì)機、渦旋混合器、離心機(轉(zhuǎn)速8000r/min)、氮吹儀、有機濾膜(0.22μm)，金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品(sigma公司，含量≥98%)；D6-金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品(sigma公司，含量≥98%)；生鮮雞蛋(購于超市)，冰乙酸為優(yōu)級純，甲醇、乙腈、甲酸、正己烷為色譜純；水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 精密稱取金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品和D6-金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品各10mg，分置10ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度各為1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。分別精密量取金剛烷胺貯備液和D6-金剛烷胺貯備液各100μl，分置100ml容量瓶中，用20%乙腈水溶液稀釋至刻度，配制成濃度各為1μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2 樣品前處理 稱取試料2.0±0.05g(精確至0.01g)置50ml離心管中，加入1μg/ml D6-金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)工作液20μl，再加入1%乙酸乙腈溶液10ml，渦旋2min，8000r/min離心5min，上清液轉(zhuǎn)入另一50ml離心管中，重復(fù)提取一次，合并兩次上清液，備用。備用液中加入無水硫酸鈉3g，正己烷10ml，渦旋1min，8000r/min離心5min，棄去正己烷層，剩余溶液轉(zhuǎn)至另一50ml離心管中，40℃水浴氮吹至干，用1.0ml20%乙腈水溶液溶解殘渣，轉(zhuǎn)移至10ml離心管中，加入正己烷2ml，渦旋1min，8000 r/min離心5min，取下層溶液，濾過，供上機測定。

1.2.3 測定方法 （1）色譜條件：色譜柱：C1850mm×2.1mm，粒徑1.7μm；流動相：A相為0.1%甲酸甲醇溶液，B相為0.1%甲酸水溶液；；流速：0.3ml/min；進樣量：5μL。柱溫：35℃；洗脫條件如表1。（2）質(zhì)譜條件：電離模式：電噴霧正離子(ESI+)，毛細(xì)管電壓：3v，離子源溫度：150℃，脫溶劑溫度：350℃，脫溶劑氣流速：550L/h.，脫溶劑氣、錐孔氣、碰撞氣均為高純氮，采集方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，金剛烷胺的定性、定量離子見表2。（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：配制金剛烷胺濃度為2、4、10、20、100、200ng/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中內(nèi)標(biāo)D6-金剛烷胺濃度均為20ng/ml，注入高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀測定后，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中金剛烷胺峰面積和D6-金剛烷胺峰面積的比值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液中相應(yīng)金剛烷胺濃度與D6-金剛烷胺的濃度比值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（4）方法的專屬性：按照樣品前處理條件的要求進行空白試驗、空白添加試驗，采用完全相同的步驟進行平行操作，在規(guī)定的測試條件下進行檢測，確認(rèn)空白中沒有干擾定量的色譜峰。（5）方法的靈敏度：在空白雞蛋中添加金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，按確定的前處理方法處理后，經(jīng)高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測，計算信噪比。所有離子色譜峰的信噪比(S/N)滿足在3∶1以上且離子豐度比滿足要求(見表3)的最低添加量為本方法的檢出限。大于檢出限，定量離子色譜峰的信噪比(S/N)滿足在10∶1以上且回收率滿足要求的最低添加量為本方法的定量限。（6）方法的準(zhǔn)確度和精密度：采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，取3批空白試料，每批中添加金剛烷胺3μg/kg、6μg/kg、30μg/kg 3個不同濃度，每個濃度進行5份，按確定的前處理方法處理后，經(jīng)高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測，計算回收率，求批內(nèi)、批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表1 流動相梯度洗脫條件

表2 金剛烷胺、D6-金剛烷胺特征離子參考質(zhì)譜條件

表3 定性測定時相對離子豐度的最大允許偏差 (%)

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進行線性回歸，得回歸方程為：y=2.1727x+0.071，曲線的R2為0.9998，在2～200ng/ml濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 專屬性

添加樣品色譜圖在標(biāo)準(zhǔn)品相應(yīng)位置出相同的色譜峰，空白樣品無干擾，色譜圖見圖2～4。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品特征離子質(zhì)量色譜圖

圖3 雞蛋空白樣品特征離子質(zhì)量色譜圖

圖4 雞蛋空白添加金剛烷胺特征離子質(zhì)量色譜圖

2.3 靈敏度

本方法檢出限為1μg/kg，定量限為3μg/kg。

2.4 準(zhǔn)確度和精密度

在空白雞蛋中添加3個不同濃度的金剛烷胺進行回收率試驗，結(jié)果見表4?？梢娀厥章蕿?7.48%～98.15%，批內(nèi)、批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%。

表4 雞蛋中金剛烷胺的添加回收率實驗結(jié)果 (μg/kg、%)

3 討論與小結(jié)

（1）文獻報道的雞蛋中金剛烷胺的殘留檢測方法主要為液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法，該方法具有高效分離和多組分定性、定量的優(yōu)點。林濤[5]等采用氨水－乙腈提取，C18和NH2填料進行分散固相萃取凈化；艾連峰[1]等采用甲醇－1%三氯乙酸或乙腈提取，陽離子交換在線凈化柱(Cyclone MCX)凈化；吳銀良[2]等采用乙酸乙腈提取，PSA和C18填料進行分散固相萃取凈化；本研究采用1%乙酸乙腈提取，正己烷液液分配去脂凈化更為簡單，檢驗成本更為低廉。（2）齊剛[3]等以乙腈－0.2%甲酸水為流動相梯度洗脫；尹暉[6]等以0.1%甲酸乙腈－0.1甲酸水為流動相梯度洗脫，本文選擇0.1%甲酸甲醇溶液和0.1%甲酸乙腈溶液為流動相A作比較，發(fā)現(xiàn)以0.1%甲酸乙腈溶液為流動相，其特征離子質(zhì)量色譜圖的峰形和分離度不如用0.1%甲酸甲醇溶液做流動相好，最終選擇了0.1%甲酸甲醇溶液為流動相A。（3）湯曉艷[7]等以氯苯那敏為內(nèi)標(biāo)對雞蛋中金剛烷胺殘留進行定量，氯苯那敏又名撲爾敏，抗組胺類藥，主要用于鼻炎、皮膚黏膜過敏及緩解流淚、打噴嚏、流涕等感冒癥狀。存在氯苯那敏與金剛烷胺聯(lián)用治療禽流感的可能，因此金剛烷胺為陽性的樣品同時存在氯苯那敏殘留的可能也是存在的，以氯苯那敏為內(nèi)標(biāo)測定金剛烷胺存在相當(dāng)?shù)亩匡L(fēng)險。本研究采用金剛烷胺同位素D6-金剛烷胺為內(nèi)標(biāo)避免了定量風(fēng)險，且定量更為準(zhǔn)確。

本文建立的雞蛋中金剛烷胺的殘留檢測方法，前處理方法簡便；串聯(lián)質(zhì)譜法檢測定性準(zhǔn)確；同位素內(nèi)標(biāo)法定量準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好；檢出限為1μg/kg靈敏度度高，適用于雞蛋中金剛烷胺殘留量的檢測。