龍井茶茶樹種質(zhì)資源低溫保存特性研究

宋丹萍，JAGANATHAN Ganesh K.，劉 威，劉寶林

（1. 上海理工大學(xué) 能源與動(dòng)力工程學(xué)院，上海 200093；2. 上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093）

1 研究背景

茶 [Camellia sinensis （ L.） Kuntze]屬 山 茶 科（Theaceae）山茶屬（Camellia），五千多年前起源于我國(guó)西南地區(qū)，至今已遍布50多個(gè)國(guó)家。長(zhǎng)期以來，由于種間雜交引發(fā)的基因多樣性造成種質(zhì)持續(xù)分化，對(duì)茶樹原始品種構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，現(xiàn)有茶樹種質(zhì)資源的保存成為種質(zhì)生物學(xué)家面臨的重要課題。目前最為方便有效、應(yīng)用最廣泛的植物長(zhǎng)期保存策略是以低溫保存技術(shù)為主的植物種質(zhì)資源庫(kù)建設(shè)[1-2]，其技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)一般要求將種子干燥至3%～7%的含水量，并在-20 ℃環(huán)境下進(jìn)行低溫保存[3]。為此，在嘗試進(jìn)行種質(zhì)資源庫(kù)保存方式前，種子的脫水敏感性及低溫保存特性需經(jīng)科學(xué)鑒定。

近年來，國(guó)內(nèi)外諸多學(xué)者圍繞茶樹種質(zhì)資源的保存特性展開了大量研究。茶樹種質(zhì)資源具有不易被長(zhǎng)期保存及保存后發(fā)芽率低等特征，一直被視為“頑拗性種子”[4-5]，但針對(duì)其脫水敏感性的爭(zhēng)議一直存在，見表1。此外，有研究表明，茶樹種子在還未達(dá)到低溫保存的理想狀態(tài)時(shí)就已失活[6]。而其遭遇低溫脅迫時(shí)內(nèi)部的損傷機(jī)理至今仍不明確，茶樹種子在國(guó)際種質(zhì)資源庫(kù)中無法長(zhǎng)期存活的原因尚無報(bào)道。

表1 不同地域茶樹種子保存臨界含水量及低溫保存研究進(jìn)展Tab.1 Research progress of critical moisture content and cryopreservation characteristics of tea seeds in different regions

為此，本文以龍井茶種子為主要研究對(duì)象，以蘇州碧螺春茶種子及九江舜葉茶種子為對(duì)照，采用干燥（及冷凍干燥）、培養(yǎng)、低溫保存、掃描電鏡觀察等多種實(shí)驗(yàn)手段，系統(tǒng)探究了龍井茶種子的脫水敏感性、低溫適應(yīng)性及低溫?fù)p傷機(jī)制，揭示了茶樹種子無法在植物種質(zhì)資源庫(kù)建設(shè)標(biāo)準(zhǔn)下長(zhǎng)期保存的原因。

2 實(shí)驗(yàn)材料、設(shè)備與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

龍井茶樹果實(shí)采自浙江省杭州梅家塢群體種（30°27′N，120°16′E），碧螺春茶樹果實(shí)采自江蘇省蘇州西山鎮(zhèn)秉場(chǎng)茶園（31°03′N，120°11′E），舜葉茶樹果實(shí)采自江西省九江舜葉茶區(qū)（29°73′N，116°22′E），所有果實(shí)均在 2015—2016年果實(shí)正常成熟季節(jié)采集，每個(gè)果實(shí)含3～4顆棕色圓形種子，去除空粒、癟粒、未成熟和蟲蛀種子后（通過顏色及形態(tài)觀察篩選），將其立即封入密封盒并在4 ℃下保存?zhèn)溆?。所有?shí)驗(yàn)均于種子采集并在4 ℃低溫下層積2個(gè)月以后開展[15]。

根據(jù)龍井茶種子在自然環(huán)境中的成熟過程，研究將茶樹果實(shí)界定為4個(gè)成長(zhǎng)階段，自種子初步形成之日開始，每隔15 d記錄1次，直至種子全部脫落。4個(gè)成長(zhǎng)階段分別定義為：形成期、成熟早期、成熟中期、成熟后期。

2.2 種子重量及含水量測(cè)試

隨機(jī)選取800粒種子，分成8組，每組100粒，使用天平測(cè)量百粒種子的平均重量。此外，隨機(jī)選取60粒種子，分成4組，每組15粒，放入標(biāo)記過的陶瓷杯中，在103 ℃下干燥17 h（熱烘干法，ISTA 2015）。通過新鮮和干燥種子的重量差值計(jì)算含水量，具體計(jì)算方法如下：

最終含水量用3次測(cè)量值的算數(shù)平均數(shù)表示。

2.3 種子培養(yǎng)測(cè)試

先將種子放在1%的NaClO溶液中浸泡15 min，之后用蒸餾水洗凈，放入培養(yǎng)箱中，設(shè)置兩種溫度條件，一種為變溫條件（10 ℃/15 ℃，15 ℃/20 ℃，20 ℃/25 ℃，25 ℃/35 ℃），一種為恒溫條件（25 ℃）。對(duì)于所有的測(cè)試溫度，給予不同程度的光照，變溫條件給予14 h的光照，光照強(qiáng)度為25 μmol/(m2·s)。當(dāng)胚芽萌出至少2 mm后，種子視為已發(fā)芽。發(fā)芽率每天或隔天記錄1次，當(dāng)持續(xù)1星期沒有種子萌發(fā)時(shí)，記錄結(jié)束。最終發(fā)芽率測(cè)定以百分比形式體現(xiàn)。

2.4 種子干燥實(shí)驗(yàn)

為測(cè)試種子脫水敏感性，隨機(jī)選取400粒種子，放入密封塑料盒，并使用5:1比例的變色硅膠干燥4 d，環(huán)境溫度為22～24 ℃。每隔24 h取出100粒，分為4組，每組25粒，3組用于測(cè)試發(fā)芽率，1組用于測(cè)定含水量。

2.5 種子的低溫保存

在降溫處理開始前，曾將不同干燥天數(shù)的種子放入-20 ℃低溫冰箱中保存1星期，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干燥1 d及2 d的種子在經(jīng)過1星期低溫保存后基本失活（數(shù)據(jù)未在論文中標(biāo)注），因此，本實(shí)驗(yàn)采用干燥3 d的種子進(jìn)行低溫敏感性及低溫貯藏特性測(cè)試。具體方法如下：

a. 不同保存溫度測(cè)試。

將種子放入程序降溫儀，以10 ℃/min的降溫速率從20 ℃降溫至-20 ℃。當(dāng)溫度降至15 ，4，0，-20 ℃時(shí)，分別取出種子，部分使用37 ℃恒溫水浴快速?gòu)?fù)溫并進(jìn)行培養(yǎng)，另保留部分種子在相應(yīng)溫度下保存1星期后再?gòu)?fù)溫培養(yǎng)。

b. 經(jīng)不同降溫方式處理后的種子斷面形態(tài)觀察。

為研究冷凍條件對(duì)龍井茶種子結(jié)構(gòu)和形貌的影響，采用預(yù)凍—冷凍干燥—掃描電鏡（SEM）方式[16]觀察經(jīng)不同降溫處理（快速降溫至-25 ℃并快速?gòu)?fù)溫，快速降溫至-25 ℃并在該溫度區(qū)域內(nèi)保存1星期，以新鮮龍井茶種子為對(duì)照）后的種子表面和截面，通過直接觀察獲得有關(guān)冰晶尺寸形態(tài)的數(shù)據(jù)。利用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件測(cè)量并計(jì)算種子截面中的孔徑，計(jì)為種子凍干過程中的冰晶尺寸。

3 結(jié)果與分析

3.1 新鮮種子的含水量及發(fā)芽率

所采集新鮮種子經(jīng)過測(cè)試，其含水量及發(fā)芽率情況見表2，其中不同字母表示發(fā)芽率間的顯著性差異。于龍井茶種子完全成熟季節(jié)采集的樣品，含水量為36.95±2.44%，發(fā)芽率為83.33±2.08%，碧螺春的含水量及發(fā)芽率分別為34.01±5.75%和85.00±2.38%，舜葉茶的含水量和發(fā)芽率分別為33.33±1.58% 和 83.33±2.08%。

表2 研究用茶樹種子采集情況一覽表Tab.2 Details of tea seeds studied

3.2 種子的脫水敏感性

3.2.1 不同成熟階段茶樹種子脫水敏感性

茶樹種子自然環(huán)境下的成熟干燥情況如圖1所示（見下頁）。以龍井茶種子為例，含水量隨著種子的成熟而逐漸降低；發(fā)芽率首先逐漸升高，而后逐步下降，在種子的成熟中期達(dá)到頂峰，成熟后期有所下降。其中不同字母表示發(fā)芽率間的顯著性差異（P＜0.05）。

圖1 自然成熟過程中龍井茶種子含水量及發(fā)芽率變化情況Fig.1 Effect of natural drying on moisture content and germination of Longjing tea seeds

茶樹種子的人工脫水干燥情況如圖2 所示?？梢钥闯觯趯?duì)不同成熟階段種子進(jìn)行干燥脫水測(cè)試中，未完全成熟（形成期、成熟早期）的種子對(duì)脫水表現(xiàn)出較強(qiáng)的敏感性。在形成期，種子被干燥至12.04±1.82%含水量時(shí)，發(fā)芽率呈顯著下降趨勢(shì)；而成熟早期的種子，導(dǎo)致發(fā)芽率顯著下降的臨界含水量為8.86±0.51%；隨著成熟中期的到來，種子的脫水耐性達(dá)到穩(wěn)定，生命力最為旺盛，且耐受脫水的程度最好。

3.2.2 不同地域茶樹種子脫水敏感性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著脫水程度的增加，三地區(qū)采集的茶樹種子發(fā)芽率均呈下降趨勢(shì)。如圖3所示，龍井茶種子干燥至含水量約9%及6%時(shí)，仍能保持65±1.78%和33.3±1.58%的發(fā)芽率；碧螺春種子保持上述含水量的發(fā)芽率分別為63.33±1.15%和26.67±0.58%，與龍井茶種子的脫水耐性較為相似；舜葉茶種子在含水量達(dá)到7.3%左右時(shí)，有50%的發(fā)芽率。當(dāng)含水量達(dá)到5.6%左右時(shí)，碧螺春和龍井茶種子不再發(fā)芽，但舜葉茶種子仍能繼續(xù)萌發(fā)，甚至在含水量達(dá)到1.8%時(shí)，仍具有13.3%的發(fā)芽率，在本實(shí)驗(yàn)的范圍內(nèi)其臨界含水量尚未出現(xiàn)。

圖2 人工干燥測(cè)試中龍井茶種子不同成熟階段含水量對(duì)種子發(fā)芽率的影響Fig.2 Effect of artificial drying on moisture content and germination of Longjing tea seeds during different maturity stages

圖3 不同地域種子在人工干燥環(huán)境下發(fā)芽率情況表Fig.3 Total germination after artificial drying of tea seeds in different origions

由此可以看出，龍井茶、碧螺春及舜葉茶種子均能夠耐受一定程度的干燥（可被干燥至10%以下），這與郭長(zhǎng)根等[8]、王立等[9]、Chen等[13]的研究結(jié)論一致，表明茶樹種子并不具備頑拗性種子的典型特征。然而，現(xiàn)有研究中茶樹種子的臨界含水量不盡相同（見表1），如Chen等[11]界定茶樹種子的臨界含水量為32.4%，Kim等[12]的研究表明茶樹種子在被干燥至含水量為19.5%時(shí)已全部失活，而Chen等[13]報(bào)道稱采自臨滄及普洱地區(qū)的茶樹種子臨界含水量為30%[13]，表明部分茶樹種子對(duì)于干燥處理仍較敏感。綜合比較后，初步推斷茶樹種子臨界含水量不同的原因有兩方面。一是茶樹種子處于不同的成熟階段。杭州龍井茶種子的成熟時(shí)間在11月下旬，而采自江西九江的舜葉茶種子同一時(shí)間仍在生長(zhǎng)，且對(duì)于脫水敏感，在12月末才完全成熟，在其完全成熟后，含水量為11.3%的舜葉茶種子的發(fā)芽率上升至68±2.6%。這一發(fā)現(xiàn)充分說明選取合適成熟階段的茶樹種子進(jìn)行研究，對(duì)于界定茶樹種子的脫水敏感性非常重要。相似結(jié)論在Chandel等[10]的報(bào)道中也有體現(xiàn)。由圖1可知，如未完全成熟，種子很可能對(duì)脫水十分敏感，從而產(chǎn)生較高的臨界含水量。二是環(huán)境因素不同。以往關(guān)于非洲叢林的研究顯示，頑拗性種子一般尺寸較大（＞500 mg），往往在降雨量高于50 mm的月份成熟[17]。圖4給出了1981—2010年當(dāng)?shù)啬昶骄鶞囟群推骄邓浚〝?shù)據(jù)來源：中國(guó)氣象數(shù)據(jù)網(wǎng)），其中，龍井茶種子使用（■）標(biāo)記，碧螺春種子使用（●）標(biāo)記，舜葉茶種子使用（▲）標(biāo)記。在茶樹種子成熟的11月份，龍井茶種子、碧螺春茶種子及舜葉茶種子所處地區(qū)降雨量均低于50 mm，導(dǎo)致種子具有較強(qiáng)的脫水耐受力，其中又以舜葉茶種子的脫水耐受力最好，其臨界含水量遠(yuǎn)低于頑拗性種子（12%～31%）。盡管本文選取的3類種子脫水敏感性差異不顯著，但在與Chen等[13]的對(duì)比研究中可發(fā)現(xiàn)，臨滄和普洱地區(qū)茶種子成熟月份降雨量均較高，因而上述兩個(gè)地區(qū)的茶種子臨界含水量高達(dá)30%，而昆明地區(qū)在茶樹種子成熟月份的降雨量＜50 mm，其耐受脫水的能力較其他兩地較好。因此，地域及環(huán)境因素也是導(dǎo)致茶樹種子脫水敏感性不同的重要原因。

圖4 茶種子產(chǎn)地平均溫度及降雨量Fig.4 Average temperature and rainfall recorded in tea seeds origin

3.3 種子的低溫敏感性

3.3.1 凍結(jié)終溫下保存1星期對(duì)種子發(fā)芽率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，降至不同溫度的種子在經(jīng)過快速?gòu)?fù)溫后均能保持較高的發(fā)芽率，如圖5所示（見下頁）。但在不同溫度下保存1星期后，-20 ℃下保存的種子活性明顯降低（P＜0.05），僅為40±3.46%；而0，4，15 ℃下保存的種子活性與快速?gòu)?fù)溫種子的活性無顯著性差異（P＞0.05）。

圖5 降至不同溫度下（15～ -20 ℃）茶種子的發(fā)芽率Fig.5 Total germination of tea seeds after cooling to different temperatures（ 15～ -20 ℃）

此外，已有研究表明茶樹種子可在5 ℃成功保存6個(gè)月[18]。Song等[15]的研究也給出了類似結(jié)論，在0 ℃以上茶樹種子保存能力測(cè)試中，龍井茶種子在4 ℃保存7個(gè)月后，仍有73%的發(fā)芽率；但保存10個(gè)月之后，所有種子失活。另一組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，在保存時(shí)間超過12個(gè)月以后，15 ℃和0 ℃的保存環(huán)境中也沒有種子存活，證實(shí)了4 ℃保存結(jié)果的準(zhǔn)確性。然而，無論是新鮮茶種子還是干燥至7%～9%的茶種子，在-20 ℃下保存3個(gè)月后，所有的種子就已全部失活。

3.3.2 不同降溫方式對(duì)龍井茶種子微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖6 龍井茶種子斷面形態(tài)SEM圖像Fig.6 SEM images of cross-section of Longjing tea seeds

經(jīng)預(yù)凍及冷凍干燥后種子的含水量為8.03±1.55%。不同降溫處理方式對(duì)龍井茶凍干種子結(jié)構(gòu)和形態(tài)的影響如圖6和圖7所示。其中：圖6（a）～（c）為不同處理方式后的種子截面；圖 6（d）～（f）為種子截面；圖6（g）～（i）為不同處理方式后的胚軸形態(tài)；圖6（j）～（l）為不同處理方式后的胚乳形態(tài)；C為胚乳；E為胚芽；EA為胚軸。由圖6可見，降溫至-25 ℃并在-25 ℃下保存30 min的龍井茶種子內(nèi)部結(jié)構(gòu)與對(duì)照組相比變化不大，種子表面形態(tài)良好，說明降溫過程及凍干過程對(duì)種子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)并無顯著影響。而在經(jīng)預(yù)凍處理并在-25 ℃下保存1星期的龍井茶種子斷面示意圖6（i）～（l）中可見，較新鮮種子及在-25 ℃保存30 min的種子而言，種子內(nèi)部的結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，種子截面變得更為粗糙，胚軸及胚乳的形態(tài)也明顯改變。

在圖7與新鮮種子的胚軸及胚乳進(jìn)一步對(duì)比觀察中可更清楚地看到區(qū)別。其中：圖7（a）為新鮮茶種子胚軸截面；圖7（b）為-25 ℃低溫保存1星期后的胚軸截面；圖7（c）為新鮮茶種子胚乳截面；圖7（d）為-25 ℃低溫保存1星期后的胚乳截面。在圖7（a）和圖7（b）中，新鮮種子胚軸中雖有部分因干燥而形成的水份通道，但整體截面仍較為致密平滑。但低溫保存1星期后，種子胚軸中變得孔隙密布，初步推斷是在預(yù)凍階段形成的冰晶完全升華后留下的多孔通道。比較圖7（a）和圖7（b）可以看出，冷卻并在-25 ℃保存1星期后，網(wǎng)狀孔洞變得致密，孔洞數(shù)量及面積均有所增加，孔洞數(shù)量達(dá)40個(gè)以上，平均孔徑直徑為14.34±3.48 μm。而由圖 7（c）和圖 7（d）可見，新鮮茶種子的胚乳由大量平行排列的細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成，細(xì)胞大小一致，呈梭形或橢圓形，間隙很小或無間隙，排列緊密且有規(guī)則。而在低溫下凍存1星期后，原本平行排列的形態(tài)改變，排列方向無序，間隙較大，細(xì)胞形態(tài)由梭形變?yōu)闊o規(guī)則形態(tài)，表面出現(xiàn)不同程度的塌陷和斷裂。胚軸與胚乳結(jié)構(gòu)的變化均顯示出，在低溫保存過程中，種子細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)遭遇了破壞性的改變，可能是胞內(nèi)冰的形成和生長(zhǎng)，對(duì)于細(xì)胞形成了致命損傷。

圖7 龍井茶種子胚軸胚乳SEM圖像Fig.7 SEM images of embryo axis and cotyledon of Longjing tea seeds

Song 等[18]報(bào)道稱，-15～-30 °C 為龍井茶種子降溫過程中細(xì)胞中水份結(jié)晶及冰晶生長(zhǎng)的關(guān)鍵區(qū)域，快速降溫可避免種子在該溫度區(qū)域內(nèi)遭受損傷。當(dāng)降溫至該區(qū)域時(shí)，在較短的保存時(shí)間內(nèi)（如30 min）形成的細(xì)小冰晶來不及長(zhǎng)大，種子內(nèi)部的細(xì)胞結(jié)構(gòu)不會(huì)受到致命影響，因此復(fù)溫后種子發(fā)芽率仍能保持較高水平。盡管如此，若降溫至-25 ℃并將種子在該溫度長(zhǎng)時(shí)間保存后（1星期及以上），掃描電鏡觀測(cè)到的胚軸及胚乳形態(tài)的變化顯示（圖6和圖7），種子內(nèi)部發(fā)生了不同程度的低溫?cái)嗔眩瑢?duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成破壞性損傷，這可能是茶樹種子無法在種質(zhì)資源庫(kù)中長(zhǎng)期保存的關(guān)鍵原因。

此外，Song等[18]的研究顯示，將種子快速投入液氮后，種子也可維持一定的發(fā)芽率（26.7%±1.53%），說明以極快的降溫速率通過危險(xiǎn)溫區(qū)之后，種子內(nèi)部的細(xì)胞結(jié)構(gòu)并未受到明顯影響，極有可能在超低溫環(huán)境下成功保存。因此，超低溫保存可能是實(shí)現(xiàn)龍井茶樹種子長(zhǎng)期保存的唯一可行方式。未來的研究將進(jìn)一步探討超低溫保存茶樹種子的可能性，并對(duì)超低溫保存環(huán)節(jié)中有可能影響保存效果的各方面因素進(jìn)行分析及實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，從而提高茶樹種子對(duì)超低溫保存的適應(yīng)性。

4 結(jié) 論

以龍井茶種子為主要研究對(duì)象，系統(tǒng)研究了其脫水敏感性及低溫保存特性，得出如下結(jié)論：龍井茶種子能耐受一定程度的脫水（可被干燥至10%以下），對(duì)于低溫處理較為敏感（-20 ℃下保存時(shí)間不超過3個(gè)月），因而不適宜在種質(zhì)資源庫(kù)中長(zhǎng)期保存，目前唯一可行的方式為超低溫保存。此外，本文確定了龍井茶種子萌發(fā)的最佳含水量為7%～9%，并結(jié)合凍干及掃描電鏡技術(shù)推斷龍井茶種子的低溫?fù)p傷機(jī)理為破壞性的冰晶損傷，為成功實(shí)現(xiàn)茶樹種質(zhì)資源低溫保存提供了理論研究。