免疫組化法和PCR法檢測LMP-1篩查NPC的輔助診斷效果比較

龔梁 陳亮宇 熊華 陳建強 鄒堅定 魯杰

【關(guān)鍵字】EB病毒 鼻咽癌 潛伏膜蛋白1 免疫組化 聚合酶鏈反應(yīng) 診斷試驗

鼻咽癌（NPC）患者的臨床診斷多數(shù)依據(jù)鼻咽鏡及病理學(xué)檢查結(jié)果［1］，均具備一定的侵襲特征，一些患者無法一次明確診斷，需予以反復(fù)多次的活檢，存在一定不足。而潛伏膜蛋白1（LMP-1）是EB病毒所編碼的且具有癌基因功能的蛋白質(zhì)，在NPC細胞的增殖、凋亡及浸潤轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為中起到重要作用［2］。因此，有必要尋找能夠早期篩查診斷NPC的簡便方法，為臨床早診斷、早治療提供依據(jù)。作者采集NPC患者的鼻咽標(biāo)本，通過免疫組化法和PCR法檢測鼻咽癌組織中的LMP-1表達情況，分析兩種方法所檢測LMP-1水平篩查NPC的效果，為臨床診斷和免疫靶向治療提供相關(guān)參考。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選擇2013年1月至2016年12月本院鼻咽癌患者60例，男47例，女13例；年齡25～76歲，平均年齡（57.6±9.4）歲。均接受活檢組織相關(guān)病理學(xué)檢測和確診，將NPC患者相關(guān)鼻咽標(biāo)本保存實驗室。高分化癌8例、低分化鱗癌32例，未分化癌20例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例。所有患者均未行放療或化療。另選擇同期治療的鼻咽炎患者72例為對照組，收集其鼻咽標(biāo)本。男43例，女29例；年齡27～75歲，平均年齡（55.8±8.2）歲。

1.2 方法（1）標(biāo)本采集與處理：采集兩組患者的鼻咽組織標(biāo)本，使用10%中型甲醛固定，石蠟包埋，切片（厚4μm）。（2）免疫組化檢查：LMP-1相關(guān)試劑盒購自武漢中美科技有限公司，MaxVision相關(guān)免疫組化及DBA顯色相關(guān)試劑盒澤購自福州脈新公司；將石蠟標(biāo)本處理后的切片置于55℃烤箱烤片3h，二甲苯脫蠟水化，酒精梯度處理，蒸餾水清洗，使用枸櫞酸鈉緩沖液微波法修復(fù)抗原，滴加1：100的LMP-1兔抗體人多克隆抗體，4℃過夜，PBS溶液漂洗；滴加即用型MaxVision試劑，37℃孵育15min，PBS溶液漂洗；滴加DBA溶液顯色3min，蘇木精復(fù)染，中型樹膠封固，鏡檢。光鏡下細胞漿或者細胞膜上呈現(xiàn)棕黃色判斷為LMP-1陽性［3］，見圖 1。（3）PCR 檢測：PCR 儀器（美國BIO-RAD公司）、DNA試劑盒（德國QIGEN公司）、DNA聚合酶（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)公司）、高速冷凍離心機（上海博鴻公司）、CO2培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技公司）、紫外投射分析儀（上海康和光電儀器公司），參照文獻［4］，采用PCR法檢測LMP-1基因，PCR法檢測LMP-1基因的表達，見圖2。

圖1 免疫組化法檢測LMP-1的陽性表達

圖2 PCR法檢測LMP-1基因的表達

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。診斷試驗分析采用受試者工作曲線（ROC曲線）法，計算靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度及ROC曲線下面積，兩種方法的ROC曲線下面積比較采用Z檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化法檢測LMP-1篩查鼻咽癌的結(jié)果分析 免疫組化法檢測LMP-1對鼻咽癌篩查靈敏度0.633，特異性0.903，準(zhǔn)確性0.780，ROC曲線下相關(guān)面積 0.768（95%CI：0.683～0.853）。

表1 免疫組化法檢測LMP-1篩查對鼻咽癌的篩查結(jié)果

2.2 PCR法檢測LMP-1篩查鼻咽癌的結(jié)果分析 PCR法檢測LMP-1對鼻咽癌的篩查靈敏性度0.933，特異性0.875，準(zhǔn)確性0.902，ROC曲線下相關(guān)面積0.904（95%CI：0.846～0.962）。

表2 PCR法檢測LMP-1篩查鼻咽癌的結(jié)果分析

2.3 LMP-1免疫組化和PCR診斷鼻咽癌的效果比較分析 對兩種方法的ROC曲線下面積進行比較，依據(jù)Z檢驗公式，P＜0.05，提示PCR法獲得的ROC曲線下面積明顯大于免疫組化法，表明前者診斷鼻咽癌的效果更好。

3 討論

隨著鼻咽癌致癌基因的研究深入，人們試圖從染色體和基因水平確定一些鼻咽癌相關(guān)標(biāo)記物，并應(yīng)用這些標(biāo)記物建立起鼻咽癌早期診斷和預(yù)后判斷的方法。目前發(fā)現(xiàn)，EB病毒所含有LMP-1相關(guān)基因?qū)儆谥掳┗蛑唬?］，LMP-1屬于EB病毒所編碼產(chǎn)生的一種膜蛋白，EB病毒對細胞出現(xiàn)惡性改變可能由LMP-1所引發(fā)。有報道顯示，LMP-1基因可加速細胞增殖、加速細胞遷移并降低細胞間粘附分子含量，從而促進細胞的惡性轉(zhuǎn)化，特異性靶向抑制LMP-1基因表達可以抑制細胞的增殖［6］。EB病毒于成人中具備廣泛的存在現(xiàn)象，但受到EB病毒感染的相關(guān)細胞并不是均會引發(fā)LMP-1的產(chǎn)生，因此，存在EB病毒相關(guān)感染的人并不是均出現(xiàn)鼻咽癌的情況。對LMP-1基因予以測定診斷其鼻咽癌的存在，有可能和EBV相關(guān)基因組測定亦或者是EB病毒相關(guān)VCA-IgA抗體測定的特異度更高。

研究報道，采取免疫組化相關(guān)技術(shù)能檢出50%～70%鼻咽癌患者LMP-1［3］，本資料中的NPC患者鼻咽標(biāo)本LMP-1的陽性檢出率53.3%。免疫組化相關(guān)技術(shù)對LMP-1進行測定靈敏度比較低，而采取PCR方法能得到較高的靈敏度和特異性。Raymond等［7］報道，靈敏度和特異性為98.9%和99.3%；而Hao［4］報道敏感性94.7%，特異性100%。本資料靈敏度、特異度分別為90.4%、87.5%，故比免疫組化法，可獲得更好的靈敏度和準(zhǔn)確度。本資料顯示，PCR法ROC曲線下面積0.904，明顯大于免疫組化法0.768，依據(jù)ROC曲線下面積的診斷效果，若曲線下面積＞0.9，可以判斷該篩查方法診斷效果良好［8］。因此，采用PCR法檢測鼻咽標(biāo)本LMP-1基因水平，比免疫組化法具有更好的診斷效果，值得臨床推廣應(yīng)用。