老齡大鼠聽功能下降與線粒體DNA4834bp缺失突變的關(guān)系

黃海林 劉俊?

老年性耳聾是老年人中發(fā)生率較高的慢性疾病，是衰老在聽覺器官的表現(xiàn)。研究表明，衰老與線粒體功能紊亂密切相關(guān)，而線粒體功能紊亂是線粒體DNA突變引起的。Bai等［1］報道m(xù)tDNA4977缺失與老年性耳聾存在可能相關(guān)性。Fischel-Ghodsian等［2］檢測5例老年性耳聾患者膜迷路和螺旋神經(jīng)節(jié)中mtDNA編碼的細胞色素氧化酶Ⅱ基因，發(fā)現(xiàn)老年性耳聾患者mtDNA突變率高于老年對照組，但突變發(fā)生的部位和數(shù)量均存在較大個體差異。常見的線粒體DNA缺失突變片段有 13162bp，10422bp，7663bp，7436bp，4989bp，4977bp，其中人mtDNA4977bp（對應(yīng)大鼠4834bp）是mtDNA中最為常見突變類型［3］。2015年10月至2016年3月作者通過實驗研究，探討老年性聾發(fā)生的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠20只，其中24個月齡SD大鼠10只，平均（647.83±10.35）g；3個月齡SD大鼠10只，平均（210.78±5.62）g，所有動物均無噪聲暴露史及其它藥物使用史，且無中耳炎，動物由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院提供。

1.2 方法 （1）分組：20只SD大鼠經(jīng)聽性腦干反應(yīng)（ABR）檢測，排除中耳炎后按年齡分2組，各10只，24個月齡為觀察組；3個月齡為對照組。（2）檢測大鼠聽性腦干反應(yīng)（ABR）反應(yīng)閾：分別對對照組和觀察組大鼠進行ABR反應(yīng)閾測定（測定方法參照孔維佳建立方法［4］）。測試前兩組大鼠用10%水合氯醛按照0.4ml/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，使用GSI Audera腦干誘發(fā)電位儀測試。（3）蝸神經(jīng)核及內(nèi)耳組織mtDNA提取：兩組動物ABR測試結(jié)束后立即麻醉斷頭處死，首先提取腦蝸神經(jīng)核：于中線處剪開顱骨，將腦組織輕輕從顱骨中取出，根據(jù)蝸神經(jīng)核［5］定位提取腦蝸神經(jīng)核，置入勻漿器中，加入2ml勻漿液（pH7.4，0.01mol/L Tris-HCI，0.1mmol/L，0.01mol/L蔗糖）勻漿至無明顯組織塊存在（冰浴操作）。勻漿液4℃離心1000g l0min，取上清液0℃離心12000g 15min，棄上清液，沉淀物即為腦組織蝸神經(jīng)核線粒體。然后提取內(nèi)耳組織：提取雙側(cè)聽泡，置于4℃預(yù)冷的充氧無鈣鎂細胞外液中（0.1mol/L PBS，pH 7.4），體視顯微鏡下剝?nèi)ス切晕仛?，解剖出耳蝸Corti器，血管紋，螺旋神經(jīng)節(jié)等內(nèi)耳組織。蝸神經(jīng)核和內(nèi)耳組織線粒體DNA提取方法：各組織置入勻漿管，加入RIPA裂解液，再加入蛋白酶 K，至終濃度10mg/ml，搖勻混合，55℃水浴過夜消化。最后用酚-氯仿-異戊醇抽提取線粒體DNA，所得 DNA 溶于 50μl TE 溶液，-20℃保存?zhèn)溆?。?μl DNA樣本溶液稀釋至50μl，用紫外線核酸檢測儀器檢測A260/A280純度值并測定其濃度大小。（4）線粒體DNA缺失檢測分析：根據(jù)大鼠線粒體基因組全序列（Genbank序列號X 14848），并遵循引物設(shè)計原則，引物由上海生工生物工程公司合成：P1：5'-GCGAAGCTTAGAGCGTTAAC-3'，P2：5'-AGT GAG ATA AGG AAG CCT GC-3'，引物合成后用滅菌超純水稀釋成10μmol/L 的工作液，-20℃凍存。配制25μl PCR反應(yīng)體系：Taq DNA 聚合酶（2.5U）0.5μl，引物（10μM） 各 1μl，dNTPs 2μl，PCR buffer2.5μl。PCR擴增反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，反應(yīng)35個循環(huán)；末次72℃延伸7min。引物P1、P2如可以擴增597bp片段，則提示樣本中有mtDNA4834bp缺失。如樣本中無4834bp缺失突變，應(yīng)在現(xiàn)實反應(yīng)條件下無法合成近5000bp片段，故無法擴增出597bp PCR產(chǎn)物。（5）PCR產(chǎn)物鑒定與分析：各組PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色，電泳緩沖液1 X TAE，電壓100V，用凝膠成像儀掃描成像并保存結(jié)果。在紫外燈下確定597bp目的基因條帶位置，將凝膠與產(chǎn)物一起切出，用DNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN APGX-50G）分離純化。加樣后將離心管置37℃水浴1h，酶切產(chǎn)物經(jīng)2. 5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色，凝膠成像儀掃描成像并保存結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ABR反應(yīng)閾 對照組大鼠ABR平均聽閾（19.50±3.69）dB， 觀 察 組 大 鼠 ABR平 均 聽 閾（46.00±3.94）dB，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 mtDNA4834bp缺失突變電泳結(jié)果 對照組大鼠腦組織蝸神經(jīng)核樣本（10例）及內(nèi)耳組織樣本（10只）均未檢測出597bp（提示4834bp缺失）擴增條帶（見圖1），觀察組大鼠蝸神經(jīng)核樣本檢出率為100%；內(nèi)耳組織樣本檢出率90.0%。見圖2。

圖1 對照組各組織標(biāo)本PCR結(jié)果

圖2-1 觀察組蝸神經(jīng)核組織mtDNA PCR結(jié)果

圖2-2 觀察組內(nèi)耳組織mtDNA PCR結(jié)果

2.3 PCR酶切電泳 根據(jù)大鼠線粒體基因組全序列（Genbank序列號X 14848），根據(jù)DNASTAR軟件選擇限制性內(nèi)切酶（HphⅠ）酶切，酶切位點見圖3，結(jié)果證實酶切產(chǎn)物來自mtDNA4834bp特異型缺失擴增片段，見圖4。

圖3 HphⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點

圖4 PCR產(chǎn)物酶切電泳圖

3 討論

老年性耳聾發(fā)生機制目前尚不明確，大多學(xué)者認(rèn)為其由多種危險因子的長期累積共同作用形成，其中最主要因素為衰老。根據(jù)Harman［6］提出衰老的自由基學(xué)說，認(rèn)為衰老是由自由基引起的組織隨機毒害的結(jié)果，自由基損害作用的機制主要涉及DNA的損傷，尤其是mtDNA的氧化損傷，其持續(xù)產(chǎn)生于線粒體電子傳遞鏈的活性氧簇（ROS）是衰老過程中線粒體DNA氧化損傷產(chǎn)生的主要原因。由于mtDNA裸露于產(chǎn)生高氧自由基的線粒體內(nèi)膜下，本身無組蛋白的保護又缺乏損傷修復(fù)系統(tǒng)，其突變率較核DNA高10～20倍［7］，極易受氧自由基的侵襲發(fā)生氧化修飾和mtDNA突變，由缺陷的mtDNA編碼的呼吸酶影響電子轉(zhuǎn)運功能，增加電子泄露，不斷產(chǎn)生的ROS又反過來繼續(xù)氧化損害線粒體功能，導(dǎo)致不同組織細胞程度不一的mtDNA累積突變的蓄積，即“老化的線粒體理論［8］”。衰老過程中產(chǎn)生的mtDNA缺失突變型mtDNA比完整的野生型mtDNA長度小［9］，復(fù)制速度快，其增殖優(yōu)勢導(dǎo)致缺失突變型mtDNA分子比例隨年齡增長不斷累積增加。當(dāng)細胞內(nèi)突變mtDNA積累達到氧化磷酸化（OXPHOS）所生成的能量低于維持正常細胞功能閾值時，組織器官開始退化，出現(xiàn)臨床癥狀，引起老年退化性疾病，在聽覺器官表現(xiàn)為聽力逐漸下降。本實驗中對照組大鼠ABR平均聽閾為（19.50±3.69）dB peSPL，觀察組大鼠ABR平均聽閾（46.00±3.94）dB peSPL，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

老年性聾是機體衰老過程在聽覺器官的表現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)線粒體DNA突變與老年性耳聾的發(fā)生關(guān)系密切。人類mt DNA 在8483～13459bp之間存在著13bp的重復(fù)序列，在氧化應(yīng)激刺激下，易發(fā)生斷裂，在修復(fù)時由于兩端重復(fù)序列，產(chǎn)生DNA兩條鏈下游環(huán)，該堿基環(huán)富含鳥嘌呤堿基，對自由基及其敏感，一旦受到ROS攻擊，該環(huán)降解即容易導(dǎo)致“誤認(rèn)”發(fā)生了4977bp片段缺失［10］，此機制被稱為線粒體重組滑行錯配學(xué)說。此缺失在大鼠，mtDNA8103-12937bp之間存在16bp直接重復(fù)序列，故大鼠也存在類似缺失突變（mtDNA4834bp）的常見缺失（CD）。突變不僅存在衰老組織中（心肌、肝、腦、肺、腎等），還可存在于線粒體腦肌病、進行性眼外肌麻痹和Kearns-Sayre綜合征等疾病中，且隨著年齡增加在組織中逐漸積累［11］。本實驗PCR擴增出597bp片段（提示mtDNA4834bp缺失），該缺失突變編碼包括ND3，ND4，NDS，COIII，ATPaseB，ATPase6 等［12］基 因，影響呼吸鏈有關(guān)亞單位蛋白的合成，從而形成有缺陷的呼吸鏈，ATP產(chǎn)生不足導(dǎo)致蝸內(nèi)離子失平衡，內(nèi)環(huán)境紊亂，最終導(dǎo)致內(nèi)耳毛細胞非特異性損害，引起聽力下降［13］。本實驗在大鼠蝸神經(jīng)核和內(nèi)耳組織中均發(fā)現(xiàn)了mt4834bp缺失，表明該常見缺失普遍存在于衰老組織。因此以后可以通過減少和預(yù)防m(xù)tDNA缺失突變的發(fā)生，以緩解和預(yù)防老年性耳聾發(fā)生發(fā)展，從而為治療老年性耳聾提供新突破。但老年性聾不一定均有mtDNA4834bp片段缺失，本實驗中觀察組有1只未檢測到該缺失突變，表明除了基因背景以外，還有其他環(huán)境易感因素（如藥物，噪音等）在老年性聾的發(fā)病過程中起重要作用，具體機制有待于進一步的研究。