體內(nèi)外循環(huán)篩選法構(gòu)建新型的胰腺癌吉西他濱耐藥模型

嚴(yán)秋亮 陳燕 葉清煌 劉棟 張凱 朱錦輝?

胰腺癌是病死率較高的惡性腫瘤，化療效果不理想。作為治療胰腺癌的首選藥物吉西他濱，其化療有效率也僅25%［1］，多藥耐藥是導(dǎo)致化療效果欠佳的重要原因。目前國內(nèi)外對于胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞系建立多采用體外細(xì)胞培養(yǎng)的方式［2］。但這些模型不能真實(shí)反映臨床上胰腺癌耐藥多通過體內(nèi)藥物誘導(dǎo)逐步產(chǎn)生的實(shí)際現(xiàn)象，構(gòu)建更符合胰腺癌吉西他濱耐藥發(fā)生發(fā)展過程的模型有助于獲得更科學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2015年5月至2017年5月作者通過實(shí)驗(yàn)研究，使篩選的耐藥細(xì)胞株及構(gòu)建的耐藥模型更能模擬臨床胰腺癌吉西他濱耐藥的過程，區(qū)別于細(xì)胞株化療藥物單純體外階梯濃度誘導(dǎo)獲得耐藥細(xì)胞株，在體內(nèi)環(huán)境下具有更好的穩(wěn)定性?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）實(shí)驗(yàn)動物：30只雄性BALB/c裸小鼠由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，鼠齡41～57d，平均（47±12）d。質(zhì)量 18～20g，平均（19.2±0.7）g，飼養(yǎng)于恒溫25～27℃、恒濕45%～50%，且符合無特定病原體條件的裸鼠室內(nèi)，飲用水及標(biāo)準(zhǔn)食療均經(jīng)滅菌后供動物自由食用。（2）細(xì)胞株： PANC-1由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院外科研究所提供。PANC-1/R2為體外培養(yǎng)體內(nèi)誘導(dǎo)循環(huán)篩選的新方法獲得的PANC-1的吉西他濱耐藥株（由上海黃離生物技術(shù)有限公司提供）。（3）主要儀器和試劑：實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增（qPCR）儀購自Biorad公司，IS1000凝膠成像系統(tǒng)購自美國法莫西亞公司，Beckman Coul ter Avanti J-20低溫離心機(jī)購自德國Heraeus公司，Taq DNA聚合酶購自日本Takara公司，注射用鹽酸吉西他濱（健擇）（LILLY公司，批號A283463）；微衛(wèi)星位點(diǎn)分別為D14S68 、D18S69 、D20S199，引物序列檢索自NCBI的UniSTS數(shù)據(jù)庫，由上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法 （1）分組方法：將30只裸小鼠隨機(jī)分成2組，每組各15只，分別用于第一輪循壞和第二輪循環(huán)。第一輪循環(huán)：PANC-1細(xì)胞株皮下移植再原位移植的方法建模，將9×106細(xì)胞懸液接種至裸鼠的右側(cè)頸背部皮下，待長成1cm3大小后將實(shí)體瘤取出，剪切成lmm3大小的瘤塊。20g/L戊巴比妥鈉溶液45mg/kg腹腔注射麻醉裸鼠，上腹部2cm切口，剪開胰腺被膜，將1mm3大小的瘤塊植入胰尾近脾門處。每周稱重，于35d處死。胰腺癌裸鼠胰腺原位移植后7d開始，注射用鹽酸吉西他濱240mg/kg，1次/周腹腔注射，共4次，第35天處死。收集裸鼠腫瘤病灶及淋巴結(jié)和內(nèi)臟等標(biāo)本組織，將腹腔化療后瘤體最大的5個(gè)模型的瘤體組織，酶消化法進(jìn)行瘤體源性原代細(xì)胞培養(yǎng)。第二輪循環(huán)，實(shí)驗(yàn)方法同第一輪循環(huán)，即皮下成瘤，腹腔原位移植，腹腔化療，獲得瘤體組織，細(xì)胞分離培養(yǎng)等。收集兩組裸鼠腫瘤病灶及淋巴結(jié)和內(nèi)臟等標(biāo)本組織。記錄兩組裸鼠重量、腫瘤組織重量，及胰腺外淋巴、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生率，并行組間比較。（2）耐藥細(xì)胞亞群的遺傳背景鑒定：抽提模型動物胰腺組織（液氮凍存）、PANC-1/R2和親代細(xì)胞PANC-1的DNA，以其為模板，PCR法擴(kuò)增三個(gè)微衛(wèi)星序列，PCR產(chǎn)物聚丙稀酞胺凝膠電泳和銀染顯色。具體如下，PCR擴(kuò)增：10μl反應(yīng)體系中含有樣本 DNA約0.1μg，引物各5pmol，TaqDNA聚合酶0.3μl等。反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃2 min；循環(huán)94℃×30s、5 6℃×30s、72℃×30s，共36個(gè)循環(huán)；延伸56℃ 5min；顯示：PCR產(chǎn)物大小分別為 148～172bp、192～210 bp、108～126 bp，8%聚丙稀酰氨凝膠電泳和銀染顯色顯示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，多組比較用方差分析，組間兩兩比較用 Student-Newman-keuls法，相關(guān)分析采用Spearman等級相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩輪循環(huán)一般資料比較 見表1。

表1 兩輪循環(huán)一般資料比較（）

表1 兩輪循環(huán)一般資料比較（）

第一循環(huán) 第二循環(huán) P值成功率［n（%）］ 11（73） 12（80） ＞0.05死亡率［n（%）］ 2（18.2） 1（8.3） ＞0.05最大五瘤體大?。╣） 1.76±0.87 2.16±1.12 ＜0.05轉(zhuǎn)移率 1（11.1） 4（36.3） ＜0.05

2.2 不同濃度吉西他濱作用下PANC-1和PANC-1/R2細(xì)胞抑制率及瘤體重量 見表2。

表2 不同濃度吉西他濱作用下PANC-1和PANC-1/R2細(xì)胞抑制率及瘤體重量

2.3 PANC-1/R2和PANC-1細(xì)胞的遺傳學(xué)背景 人類基因組微衛(wèi)星D14S68、D18S69、D20S199檢測結(jié)果顯示，親代胰腺癌細(xì)胞、吉西他濱耐藥胰腺癌細(xì)胞三個(gè)位點(diǎn)微衛(wèi)星擴(kuò)增大小完全相同的片段，而荷瘤裸鼠胰腺組織未擴(kuò)增出相應(yīng)的帶型（見圖1）。

3 討論

圖1 a、b、c分別為D14S68、D18S69、D20S199序列PCR產(chǎn)物聚丙稀酞胺電泳銀染結(jié)果。最左邊泳道DNAmarker，1、2、3道分別代表從裸小鼠胰腺、親代細(xì)胞PANC-1、吉西他濱耐藥細(xì)胞PANC-1/R2中擴(kuò)增產(chǎn)物?？梢姷?、3泳道擴(kuò)增產(chǎn)物完全一致，第1泳道未擴(kuò)增相應(yīng)的條帶

構(gòu)建相應(yīng)動物及細(xì)胞模型是研究腫瘤發(fā)生發(fā)展重要的部分，建立具有明確特征的腫瘤模型是研究和揭示腫瘤分子機(jī)制的關(guān)鍵平臺。胰腺癌惡性程度高，術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率高，化療藥物作用效果差異大，胰腺癌的治療效果欠佳。腫瘤對化療藥物的耐藥是降低胰腺癌治療效果的重要原因之一。構(gòu)建模擬腫瘤生物學(xué)特征的動物模型是腫瘤學(xué)研究的重要步驟。國內(nèi)外的學(xué)者構(gòu)建了多種胰腺癌模型：通過瘤塊移植構(gòu)建胰腺癌模型，原位移植法構(gòu)建淋巴轉(zhuǎn)移模型，腹腔注射構(gòu)建胰腺癌腹膜轉(zhuǎn)移模型等［3］。本研究顯示，在移植瘤移植5周后，移植成功率達(dá)73.3%～80%，轉(zhuǎn)移率達(dá)到11.1%～37%，具有制模時(shí)間短、成瘤率高、轉(zhuǎn)移率高的特點(diǎn)。與其他胰腺癌動物模型比較，其生物學(xué)行為與人類胰腺癌極為接近，模擬同原發(fā)腫瘤發(fā)病部位相似的腫瘤微環(huán)境（胰腺體尾部腫瘤），能在相應(yīng)部位形成轉(zhuǎn)移灶，避免因移植位點(diǎn)特異性引起的假陽性，對胰腺癌的自然病程進(jìn)行模擬，可以認(rèn)為是一較理想的“擬人”胰腺癌轉(zhuǎn)移模型［4］。該模型的主要缺點(diǎn)在于手術(shù)技術(shù)要求較高，且裸鼠耐受能力較差，操作過程有一定的死亡率，本資料達(dá)8.3%～18.3%，故在制模時(shí)要求較高的實(shí)驗(yàn)條件及操作技術(shù)。

對于耐藥細(xì)胞系的建立，目前所采用的幾乎均是體外培養(yǎng)，藥物階梯濃度誘導(dǎo)馴化的方法。具體到培養(yǎng)手段，可以是培養(yǎng)液中加入藥物，也可以是培養(yǎng)基中加入藥物。該方法原理簡單，但不易掌握，失敗率高。最重要的是不能充分模擬臨床上化療藥物多藥耐藥產(chǎn)生的實(shí)際過程［5］。以其為研究平臺獲得的結(jié)果有時(shí)無法反映人體復(fù)雜的多因素作用過程。因此，本研究設(shè)計(jì)了全新的胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞及動物模型，即體外培養(yǎng)-體內(nèi)誘導(dǎo)循環(huán)篩選法構(gòu)建胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞及動物模型。該方法充分模擬人體胰腺癌產(chǎn)生吉西他濱耐藥的過程，本資料僅循環(huán)篩選2輪，其耐藥特征已較明顯，理論上再循環(huán)數(shù)次其耐藥特征將更顯著。

經(jīng)過2輪的篩選，獲得胰腺癌吉西他濱的耐藥細(xì)胞，命名為PANC-1/R2。按此方法，若經(jīng)后增加循環(huán)次數(shù)（m），其命名方法即為PANC-1/Rm。該方法易于標(biāo)記，也能明確篩選和循環(huán)次數(shù)。評價(jià)篩選的耐藥細(xì)胞株，體內(nèi)及體外的耐藥實(shí)驗(yàn)是必不可少的［6］。本研究測定了三種不同吉西他濱濃度作用下，親代細(xì)胞PANC-1和耐藥細(xì)胞系PANC-1/R2的抑制率，分別是21.8%、37.1%、46.1%和12.6%、25.3%、36.8%， 耐藥細(xì)胞系PANC-1/R2的抑制率均明顯小于親代，可見其抗吉西他濱作用明顯強(qiáng)于親代細(xì)胞，表現(xiàn)出明顯的耐藥性。而用PANC-1和PANC-1/R2分別構(gòu)建胰腺癌動物模型，吉西他濱腹腔注射治療后，獲取瘤體，PANC-1/R2瘤體重量為（2.19±0.71）g，明顯高于PANC-1的（1.87±0.69）g。這種通過體內(nèi)外的耐藥實(shí)驗(yàn)可以直觀的明確細(xì)胞的耐藥性，較通過測定耐藥相關(guān)基因表達(dá)ABCG2、ABCB1 和 PLK1等更簡便而確切。

通過這種循環(huán)篩選的方法，篩選的次數(shù)越多，腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)變異及遺傳變異的機(jī)會增多。特別在免疫缺陷的實(shí)驗(yàn)動物中進(jìn)行人類腫瘤移植實(shí)驗(yàn)可能誘發(fā)宿主自發(fā)瘤，為此，必須證明篩選的亞群細(xì)胞與親代細(xì)胞是否具有一致的遺傳背景，即遺傳同源性。本實(shí)驗(yàn)從親代與傳代細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動物胰腺組織中擴(kuò)增人類特異的 D14S68、D18S69、D20S199三個(gè)微衛(wèi)星序列［7］，結(jié)果顯示，親代與耐藥亞群細(xì)胞3個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物片段完全相同，而裸小鼠正常胰腺未擴(kuò)增出相應(yīng)的產(chǎn)物片段，這既證實(shí)耐藥瘤體完全來源于原腫瘤模型，也表明該移植模型經(jīng)過體內(nèi)連續(xù)傳代，仍保留其遺傳穩(wěn)定性。本次實(shí)驗(yàn)成功篩選和分離吉西他濱耐藥特征的胰腺癌細(xì)胞，為胰腺癌耐藥實(shí)驗(yàn)研究提供了一個(gè)良好的實(shí)驗(yàn)工具。通過比較這種亞群細(xì)胞和親代細(xì)胞的基因表達(dá)差異網(wǎng)，可以獲得胰腺癌的化療藥物耐藥相關(guān)分子表達(dá)譜，有利于推動胰腺癌耐藥的分子機(jī)制研究，并為胰腺癌化療增敏提高預(yù)后和干預(yù)提供可能的靶分子。