肺結(jié)核患者肺組織微生物組特征研究

王宇軒 王沖 董宇杰 杜偉麗 宋婧 劉子臣 李琨 劉樹庫(kù) 車南穎

微生物組是指某一特定環(huán)境內(nèi)全部微生物的總和。目前普遍認(rèn)為，人體內(nèi)有很多共生微生物菌群，其基因組含量總和是人類基因組總和的100倍，這些菌群無(wú)法通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法進(jìn)行鑒定，但與人類的健康與疾病息息相關(guān)。新一代高通量測(cè)序(next generation sequencing，NGS)技術(shù)通過對(duì)環(huán)境中16S rRNA進(jìn)行測(cè)序，幾乎能檢測(cè)到環(huán)境中所有的微生物，這使特定生物樣品中微生物組的研究成為現(xiàn)實(shí)。有研究通過NGS技術(shù)表明，肺部存在微生物，證明肺部不是無(wú)菌的，并且這些微生物分布特征與肺部的健康與疾病狀態(tài)有著一定的關(guān)聯(lián)[1-3]。已經(jīng)有研究表明，一些慢性肺部疾病如慢性阻塞性肺疾病，其疾病的發(fā)生發(fā)展與肺部微生物的改變有很大關(guān)系[4-6]。當(dāng)前對(duì)于肺結(jié)核患者的肺部微生物組特征的研究非常有限，已有研究主要使用不同患者的痰或支氣管灌洗液等新鮮標(biāo)本來(lái)研究肺部微生物組，但這些標(biāo)本的獲取都是通過氣管與支氣管，無(wú)法研究同一患者不同部位的微生物組差異，這就難以反映肺部微生物組最真實(shí)的分布及變化。目前，從福爾馬林固定石蠟包埋(formalin-fixed and paraffin-embedded，F(xiàn)FPE)的組織標(biāo)本中提取DNA的技術(shù)已經(jīng)非常成熟，可以使用測(cè)序方法檢測(cè)到抗酸桿菌的DNA[7]。FFPE組織標(biāo)本具有可以長(zhǎng)期保存和可重復(fù)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，這使其能廣泛應(yīng)用在臨床病理診斷的項(xiàng)目中，如結(jié)核分枝桿菌(MTB)的檢測(cè)和腫瘤基因突變。筆者采用激光顯微切割技術(shù)，按照肺結(jié)核病理組織分類將同一患者的FFPE組織切片分為壞死區(qū)、肉芽腫區(qū)和無(wú)病變正常肺區(qū)，采用NGS技術(shù)對(duì)配對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)序，探索肺部不同病變區(qū)和正常區(qū)的微生物組特征，以期為臨床診斷提供一定依據(jù)。

材料和方法

1.組織標(biāo)本：選取2016—2017年首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院10例臨床及病理確診為肺結(jié)核患者的FFPE手術(shù)治療標(biāo)本。對(duì)10例患者的FFPE標(biāo)本進(jìn)行切片、撈片、蘇木素-伊紅染色(hematoxyli-neosin staining，HE)，在顯微鏡下觀察并選取典型的結(jié)核病灶。壞死區(qū)域選取標(biāo)準(zhǔn)：鏡下觀為紅染無(wú)結(jié)構(gòu)的顆粒狀物；肉芽腫區(qū)域選取標(biāo)準(zhǔn)：鏡下觀為類上皮細(xì)胞、郎漢斯巨細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞；無(wú)病變正常肺區(qū)域(簡(jiǎn)稱“正常肺區(qū)”)選取標(biāo)準(zhǔn)：鏡下觀肺泡間隔纖細(xì)，肺泡壁上90%以上為Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞。

2.顯微切割：使用LEICA RM2135(德國(guó)Leica公司)切片機(jī)將每個(gè)FFPE組織切8～12張4 μm厚的樣品切片至LEICA HI1220(德國(guó)Leica公司)攤片機(jī)中，撈取置LEICA Membrane Slides(德國(guó)Leica公司)專用載玻片上。使用LEICA AUTO STAINER XL(德國(guó)Leica公司)全自動(dòng)染色儀進(jìn)行HE染色，染色后不封片。將染色后的玻片置于LEICA LMD7000(德國(guó)Leica公司)激光顯微切割儀上，根據(jù)上述提到的鏡下形態(tài)及組織大小，切割所需組織，使用離心管收集組織片。

3.DNA提取：提取通過顯微切割收集的不同區(qū)域的組織片中的DNA。在裝有組織片的離心管中加入250 μl DNA裂解液后，放入TIB核酸提純儀[泰普生物科學(xué)(中國(guó))有限公司]中并選擇DNA程序30 min。按照TIB DNA-FFPE-RY[泰普生物科學(xué)(中國(guó))有限公司]核酸提取試劑說明進(jìn)行提取。最終，用50 μl洗脫緩沖液將提取到的DNA洗脫至1.5 ml離心管中。

4.PCR擴(kuò)增及質(zhì)量控制：使用地球微生物組計(jì)劃推薦的16S rRNA V4區(qū)域通用引物(515F-GCTCCAGCMGCCGTAA，806R-GGACTACHV-GGGTWTCTAAT)進(jìn)行PCR，擴(kuò)增16S rRNA基因。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增試劑盒和PCR儀分別采用2×KAPA HiFi HotStart Ready Mix(美國(guó)Kapa Biosystems公司)和BIO-RAD C1000 Touch(美國(guó)Bio-Rad公司)。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，45 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，10個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。使用2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，選出擴(kuò)增條帶為500 bp左右的樣本，采用AMPure XP Beads(美國(guó)Beckman Coulter公司)磁珠純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

5.測(cè)序及原始數(shù)據(jù)處理：采用Illumina HiSeq PE250(美國(guó)Illumina公司)測(cè)序儀對(duì)不同區(qū)域的組織DNA進(jìn)行高通量測(cè)序。采用QIIME 1.8.0對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾、拼接，得到的有效數(shù)據(jù)做OTU(operational taxonomic units)聚類和物種注釋分析。根據(jù)GREENGENE數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)OTU的代表序列做物種注釋，得到對(duì)應(yīng)的物種信息和物種的相對(duì)豐度分布情況。應(yīng)用goods_coverage表示測(cè)序深度能否覆蓋樣品中全部微生物；Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)表示樣品物種多樣性。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用原始數(shù)據(jù)，在Rv 3.5軟件中計(jì)算出微生物組屬水平的Bray-Curtis距離用于主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)，并利用非參數(shù)多元方差分析進(jìn)行組間差異分析。通過SIMCA-P對(duì)物種相對(duì)豐度做偏最小二乘法判別分析(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)得到變量投影重要性(variable important projection，VIP)值，采用SPSS 21.0軟件對(duì)物種相對(duì)豐度進(jìn)行配對(duì)樣品非參數(shù)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)確定組間有差異的菌種，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用Rv 3.5軟件，將門水平和屬水平的物種信息繪制成韋恩圖。在GraphPad Prism 5軟件中，將不同組織區(qū)域的物種相對(duì)豐度繪制箱型圖和折線圖。

結(jié) 果

1.樣本信息及物種多樣性：10例患者石蠟樣品切片依次按照壞死區(qū)、肉芽腫區(qū)、正常肺區(qū)進(jìn)行顯微切割，得到30份配對(duì)樣本，其中27份測(cè)序成功，3份因樣品微生物DNA含量較低而導(dǎo)致測(cè)序失敗，最終得到8例患者(24份)完整的配對(duì)樣品結(jié)果，2例患者(3份)非配對(duì)樣品結(jié)果。所有樣品的goods_coverage均>99.9%，說明所獲得的高通量序列能覆蓋樣本中幾乎所有的微生物。Chao 1和Shannon指數(shù)壞死區(qū)分別為359.18±77.88和4.19±0.39；肉芽腫區(qū)分別為298.83±40.23和3.73±0.39；正常肺區(qū)分別為257.16±48.37和3.59±0.48。將基于屬水平的Bray-Curtis距離的β多樣性結(jié)果做PCoA排序分析(圖1)，結(jié)果表明除正常肺區(qū)樣品外，病灶區(qū)域即壞死區(qū)和肉芽腫區(qū)樣品聚集到一起，說明正常肺區(qū)和病灶區(qū)的微生物群落組成有差異。

圖中各點(diǎn)距離代表不同樣本間微生物組特征差異，PCoA1為最大解釋數(shù)據(jù)變化的主坐標(biāo)成分，PCoA2為解釋余下的變化度中占比例最大的主坐標(biāo)成分圖1 肺結(jié)核患者病理組織石蠟樣品切片不同病理組織分類區(qū)域主成分分析

圖2 肺結(jié)核患者肺部各區(qū)域門水平及屬水平微生物分布韋恩圖

2.門水平微生物組特征：在門水平上，肺部微生物成功注釋到的有30種，其中壞死區(qū)27種，肉芽腫區(qū)21種，正常肺區(qū)23種，3種區(qū)域共有的細(xì)菌有19種(圖2)。肺結(jié)核患者肺部微生物主要含有Proteobacteria、Actinobacteria、Firmicutes、TM7和Bacteroidetes(表1)。Adonis分析顯示壞死區(qū)與肉芽腫區(qū)(F=1.39，P=0.261)，壞死區(qū)與正常肺區(qū)(F=1.33，P=0.271)，以及肉芽腫區(qū)與正常肺區(qū)(F=1.118，P=0.323)之間的微生物群落組成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；贐ray-Curtis距離的Adonis分析表明，3種不同組織區(qū)域的微生物群落組成在門水平上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 主要微生物在肺結(jié)核患者肺部各區(qū)域門水平相對(duì)豐度的比較

3.屬水平微生物組特征：本研究的27個(gè)樣本在屬水平上共注釋236個(gè)屬，其中壞死區(qū)有203個(gè)，肉芽腫區(qū)190個(gè)，正常肺區(qū)171個(gè)，3種區(qū)域共有的類群有139個(gè)屬(圖2)?；贐ray-Curtis距離的多元方差分析表明，壞死區(qū)和肉芽腫區(qū)的微生物組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.11，P=0.288)，而壞死區(qū)和正常肺區(qū)(F=3.94，P=0.005)，肉芽腫區(qū)和正常肺區(qū)(F=4.76，P=0.002)的微生物組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？偟膩?lái)說肺結(jié)核患者肺部微生物主要含有7個(gè)主要屬(相對(duì)豐度>1%)，依次為Ochrobactrum、Sphingomonas、Corynebacterium、Brevundimonas、Brevibacterium、Sphingobacterium和Enhydrobacter。在相對(duì)豐度<1%的屬中，PLS-DA分析表明Kocuria和Tsukamurella在不同的組織部位差異較大(表2)。

表2 主要微生物在肺結(jié)核患者肺部各區(qū)域?qū)偎较鄬?duì)豐度的比較

圖3 肺結(jié)核患者肺部不同區(qū)域?qū)偎讲糠治⑸锏南鄬?duì)豐度差異

根據(jù)細(xì)菌的相對(duì)豐度和組間非參數(shù)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)P值(P<0.05)，確定了8種在肺結(jié)核患者肺組織中比較重要的微生物，它們?cè)诓煌M織部位的相對(duì)豐度差異以箱型圖展示(圖3)。從圖中可以看出，Ochrobactrum(Z=2.31，P=0.021)和Brevundimonas(Z=2.31，P=0.021)在正常肺區(qū)的相對(duì)豐度高于壞死區(qū)。Sphingomonas(Z值分別為-2.89和3.02，P值均<0.05)和Kocuria(Z值分別為-3.75和3.58，P值均<0.05)在壞死區(qū)和肉芽腫區(qū)的相對(duì)豐度均高于正常肺區(qū)。Enhydrobacter(Z=-2.49，P=0.012)在壞死區(qū)的相對(duì)豐度高于肉芽腫區(qū)。Sphingobacterium(Z值分別為2.31和-2.78，P值均<0.05)在正常肺區(qū)的相對(duì)豐度高于壞死區(qū)和肉芽腫區(qū)。Tsukamurella(Z值分別為2.04和2.60，P值均<0.05)在正常肺區(qū)的相對(duì)豐度高于壞死區(qū)和肉芽腫區(qū)。Mycobacterium(Z值分別為-2.84和-2.79，P值均<0.05)在壞死區(qū)的相對(duì)豐度高于肉芽腫區(qū)和正常肺區(qū)。

同時(shí)，將成功配對(duì)的8例患者標(biāo)本中上述8種重要微生物的相對(duì)豐度用折線圖展示(圖4)。從圖中可以看出，Ochrobactrum在正常肺的相對(duì)豐度與壞死區(qū)相比呈上升趨勢(shì)(Z=2.10，P=0.036)。Sphingomonas(Z值分別為-2.38和2.38，P值均<0.05)在正常肺區(qū)的相對(duì)豐度相比于壞死區(qū)和肉芽腫區(qū)下降。Enhydrobacter(Z值分別為2.10和-2.38，P值均<0.05)和Mycobacterium(Z值分別為2.10和-2.37，P值均<0.05)在壞死區(qū)的相對(duì)豐度相比于肉芽腫區(qū)和正常肺區(qū)上升。Sphingo-bacterium(Z值分別為2.52和-2.10，P值均<0.05)和Kocuria(Z值分別為-2.52和2.37，P值均<0.05)在正常肺區(qū)的相對(duì)豐度相比于壞死區(qū)和肉芽腫區(qū)上升。Brevundimonas和Tsukamurella的相對(duì)豐度沒有明顯變化。此外，配對(duì)樣品相對(duì)豐度結(jié)果表明肺結(jié)核致病菌Mycobacterium并不是肺結(jié)核患者肺中主要的微生物，這類致病菌主要存在于肺結(jié)核病灶的壞死區(qū)(表3)。

表3 主要微生物在肺結(jié)核配對(duì)患者肺部各區(qū)域?qū)偎较鄬?duì)豐度的比較

圖4 8例樣品配對(duì)肺結(jié)核患者肺部各區(qū)域?qū)偎讲糠治⑸锓植嫉淖兓厔?shì)

討 論

筆者探索了肺結(jié)核患者肺部不同組織區(qū)域配對(duì)樣品的微生物組特征。在屬水平上，壞死區(qū)和肉芽腫區(qū)微生物組分布特征未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而壞死區(qū)和正常肺區(qū)，肉芽腫區(qū)和正常肺區(qū)中微生物群落組成差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究表明，肺結(jié)核患者痰液中的微生物種類遠(yuǎn)高于健康人群[8-9]，這與筆者研究結(jié)果基本一致。無(wú)論從門水平還是屬水平上，結(jié)核病肺部壞死區(qū)注釋到的物種都是最多的，這可能和壞死區(qū)組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變有關(guān)。Cheung等[10]對(duì)肺組織新鮮標(biāo)本的研究結(jié)果表明，肺部微生物在門水平上主要有Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes和Actinobacteria。這與筆者研究結(jié)果一致，即無(wú)論是在病灶區(qū)域，還是在遠(yuǎn)離病灶的正常肺組織中，主要的微生物類群也為以上4種。此外，筆者還發(fā)現(xiàn)在肺部存在TM7類群并占據(jù)較高的相對(duì)豐度。目前TM7無(wú)法通過培養(yǎng)獲得，對(duì)其研究甚少。He等[11]從口腔中發(fā)現(xiàn)了TM7門，認(rèn)為其會(huì)抑制巨噬細(xì)胞中的腫瘤壞死因子α(TNF-α)的誘導(dǎo)表達(dá)，從而抑制體內(nèi)的免疫應(yīng)答。

研究表明，肺部主要的微生物有Sphingomonas、Streptococcus、Prevotella和Veillonella等[1-2]。筆者采用肺部配對(duì)FFPE組織來(lái)直接反映肺部不同組織部位的微生物分布特征，結(jié)果表明無(wú)論是壞死區(qū)、肉芽腫區(qū)還是正常肺區(qū)，Ochrobactrum、Sphingomonas、Corynebacterium、Brevundimonas、Brevibacterium、Sphingobacterium和Enhydrobacter均為主要類群。Zhou等[12]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核病患者患側(cè)肺和健側(cè)肺患者的肺部微生物組是相似的，這與筆者研究結(jié)果一致。此外，筆者發(fā)現(xiàn)即使是肺結(jié)核病灶的壞死區(qū)，Mycobacterium依然不是優(yōu)勢(shì)菌種，這和很多實(shí)驗(yàn)室的研究是一致的[12-15]。而對(duì)于結(jié)核病與正常肺之間微生物組屬水平的差異，筆者研究結(jié)果表明Sphingomonas、Enhydrobacter、Kocuria以及Mycobacterium的相對(duì)豐度從壞死區(qū)、肉芽腫區(qū)到正常肺區(qū)呈下降趨勢(shì)。Ochrobactrum和Sphingobacterium屬的相對(duì)豐度呈上升趨勢(shì)。之前已有學(xué)者利用新鮮樣本研究肺結(jié)核患者微生物分布特征。Wu等[14]研究表明，結(jié)核病患者痰液中Streptococcus、Pseudomonadaceae和Gramulicatella相對(duì)豐度較高。Krishna等[15]研究表明，結(jié)核病患者痰液中Rothia、Leuconostoc和Lactobacillu相對(duì)豐度較高。不同實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果并不完全相同，原因可能是肺部微生物組的特征受到地域、飲食、環(huán)境等很多因素的影響，并且個(gè)體之間也存在著一定差異。其次，Hahn等[16]研究表明，不同的測(cè)序儀或不同的擴(kuò)增片段都會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響。此外，以往研究者們大多使用痰液或支氣管灌洗液來(lái)研究肺部微生物組特征，這難以排除口腔菌群的影響。筆者使用FFPE樣品，與以往研究的樣本類型不同，可能也會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響，但仍然需要進(jìn)一步的研究。

對(duì)于肺結(jié)核患者而言，結(jié)核分枝桿菌是致病菌，在臨床病理工作中主要通過抗酸染色來(lái)診斷其感染，并且Mycobacterium主要存在于病灶的壞死區(qū)中。筆者通過高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)，Mycobacterium的相對(duì)豐度在壞死區(qū)最高，而在肉芽腫區(qū)和正常肺區(qū)中幾乎檢測(cè)不到，這與臨床實(shí)際情況相符。Botero等[9]也對(duì)結(jié)核分枝桿菌存在的位置進(jìn)行過研究，結(jié)果表明其只存在于痰中，而不存在于口咽。

筆者通過使用配對(duì)樣品揭示了肺部常駐微生物組特征及肺結(jié)核患者肺部微生物組的變化。但依然存在一定的不足，首先本研究揭示了肺部微生物組在肺結(jié)核患者病灶區(qū)和正常肺中的分布特征，但并未對(duì)這些微生物的致病性做進(jìn)一步研究。其次，本次研究樣本量較小，可能會(huì)對(duì)結(jié)果造成一定偏倚，這就限制了壞死區(qū)Mycobacterium與其他微生物類群相關(guān)性的研究。在未來(lái)的研究中，應(yīng)擴(kuò)大樣本量來(lái)探索肺結(jié)核患者病灶中微生物之間的相互作用關(guān)系，來(lái)明確Mycobacterium在感染過程中對(duì)正常肺部微生物組成的影響。

綜上所述，筆者使用肺結(jié)核手術(shù)患者的FFPE配對(duì)樣本，利用顯微切割技術(shù)，直接真實(shí)地展示了肺結(jié)核患者肺部病灶區(qū)和正常區(qū)的微生物組分布特征和差異。本次研究發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)核患者肺部微生物組成在壞死區(qū)、肉芽腫區(qū)和正常肺區(qū)中有一定的分布規(guī)律，而致病菌結(jié)核分枝桿菌主要存在于壞死區(qū)中。不同病變區(qū)域微生物組群落差異與肺結(jié)核疾病的發(fā)生和發(fā)展可能有一定的相關(guān)性。