屋久島紫薇子葉愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生技術(shù)初探

陳 紅,陸小清,王傳永,蔡小龍,張 凡,周艷威,李云龍

(江蘇省中國科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園),江蘇 南京 21004)

紫薇(LagerstroemiaindicaLinn)屬于千屈菜科(Lythraceae)紫薇屬[1]木本植物,原產(chǎn)我國,是我國傳統(tǒng)名花之一。紫薇通常用作落葉灌木或喬木栽植,由于紫薇花開在夏季少花季節(jié),且花期長,花色艷麗，樹干光滑，樹姿優(yōu)美,抗污染,常作為行道樹、街景樹栽培,有些城市以紫薇作為市花。其中,屋久島紫薇(L.fauriei)的樹干呈棕紅色片狀剝落,在冬季棕紅色樹干格外醒目,且抗白粉病能力較強(qiáng),是園林育種不可多得的優(yōu)良親本。

國外在株型、花色、抗病方面,已經(jīng)培育出紅色花的紫薇新品種和矮化紫薇新品種。美國育種學(xué)家Egolf通過傳統(tǒng)的育種技術(shù)利用屋久島紫薇選育出抗白粉病且花色紅艷的品種[2];日本利用從我國引進(jìn)的紫薇資源,選育出矮生多花品種。我國擁有豐富的紫薇種質(zhì)資源,其中很多資源具有較高的經(jīng)濟(jì)價值,觀賞價值和可利用的優(yōu)異基因,應(yīng)充分挖掘紫薇的優(yōu)異基因,為創(chuàng)制紫薇新品種做準(zhǔn)備。由于傳統(tǒng)的遺傳育種具有較大的盲目性,選育周期長等缺點,而現(xiàn)代的細(xì)胞工程育種和分子育種等手段克服了這些缺點。

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,以用基因工程為核心的分子育種技術(shù)已廣泛應(yīng)用于花卉育種與改良[3-5]。人們開始關(guān)注觀賞植物花色基因的轉(zhuǎn)化[6],而這一轉(zhuǎn)化的實現(xiàn)都要以組織培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)。目前絕大多數(shù)的遺傳轉(zhuǎn)化體系都需要建立一個穩(wěn)定的植株再生體系來進(jìn)行基因的轉(zhuǎn)移,再生體系已被廣泛用于植株遺傳改良。蔡明等用紫薇1年生枝條為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)與再生的研究,篩選出紫薇離體再生的最適條件[7]。王闖等與王丹等用矮生紫薇種子萌發(fā)的新生芽為外植體,進(jìn)行不同外源濃度激素處理,摸索矮生紫薇的再生條件[8-9]。

屋久島紫薇作為園林育種的優(yōu)良材料,同時在育種工作中也得到廣泛的應(yīng)用。但屋久島紫薇的再生體系的建立卻鮮見報道,本研究立足于其子葉愈傷組織的誘導(dǎo)及其再生技術(shù)的探索，為屋久島紫薇的遺傳轉(zhuǎn)化以及分子育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取江蘇省中國科學(xué)院植物研究所苗圃內(nèi),屋久島紫薇健康母樹上發(fā)育良好的種子為試驗材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料獲得及方法 采收屋久島紫薇健康母樹上發(fā)育良好的種子,人工去掉種翅，防止損傷種皮,先用自來水沖洗30 min,然后75%乙醇處理30 s，再用無菌水沖洗2—3次,緊接用 1% 次氯酸鈉滅菌15 min,然后無菌水沖洗3—5 次。消毒后播種于 MS 基本培養(yǎng)基中,獲得生長健壯的實生苗。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo) 剪取無菌苗子葉,垂直葉片主脈方向剪3—4下,保持一側(cè)葉緣相連,葉片正面朝上接種于1/2MS+(0.5,1.0 mg/L)6-BA+(0.2,0.5,1.0 mg/L)2,4-D+30g/L蔗糖+6 g/L瓊脂的培養(yǎng)基中,暗培養(yǎng)處理7 d,每瓶接種葉片3片,每種處理分別接種10瓶,重復(fù)3次。7 d后,置于光照培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)溫度23—25 ℃,光照度為2 000—3 000 lx,光照時間14 h/d。30 d后統(tǒng)計結(jié)果。誘導(dǎo)率(%)=(誘導(dǎo)出的愈傷組織數(shù)/接種材料總數(shù))×100。

1.2.3 愈傷組織的增殖 將愈傷組織切成直徑 6—10 mm接種于附加不同質(zhì)量濃度的6-BA(1.0,1.5 mg/L)與NAA(0.05,0.1 mg/L)組合的MS增殖培養(yǎng)基,共4個組合。每瓶培養(yǎng)基接愈傷組織5塊,暗培養(yǎng)溫度為23—27 ℃,每隔20 d繼代1次,60 d后觀察并統(tǒng)計結(jié)果。

1.2.4 愈傷組織的分化 將愈傷組織接種于WPM+ (1.0,2.0 mg/L)6-BA+(0.2,0.5 mg/L)IBA+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂的培養(yǎng)基中進(jìn)行再分化誘導(dǎo),每瓶接種愈傷組織2塊,每處理分別接種15瓶,重復(fù)2次。培養(yǎng)溫度為25 ℃,光照度2 000—3 000 lx,光照時間14 h/d, 50 d后統(tǒng)計結(jié)果。

分化率(%)=(分化的愈傷組織數(shù)/接種愈傷組織總數(shù))×100。

1.2.5 練苗與移栽 無菌生根苗開瓶練苗5—7 d 后移栽到大棚苗床中,使用帶孔PVC膜覆蓋保濕,放在通風(fēng)陰涼處培養(yǎng)25—30 d,培養(yǎng)到第15 d將PVC膜移除,換用遮光率75%—80%的遮陽網(wǎng),栽培所用基質(zhì)成分分別為珍珠巖、泥炭土、等容積的泥炭土+珍珠巖混合物等3種基質(zhì)中。20 d后,觀察植株長勢，并計算其成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)

愈傷組織的誘導(dǎo)試驗結(jié)果表明,隨著2,4-D質(zhì)量濃度的增加,愈傷組織的誘導(dǎo)率上升,但是愈傷組織的狀態(tài)由綠色緊實狀變成白色泡沫狀。白色泡沫狀的愈傷組織生命力弱,不能進(jìn)行進(jìn)一步分化,且隨著培養(yǎng)時間的延長,最終褐化死亡。由表2可知,子葉愈傷誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基成分為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5mg/L 2,4-D。屋久島紫薇子葉愈傷組織的誘導(dǎo)情況如圖1。

表1 6-BA與2,4-D處理對紫薇子葉愈傷誘導(dǎo)的影響

圖1 屋久島紫薇子葉愈傷組織的誘導(dǎo)

2.2 不同質(zhì)量濃度6-BA與NAA對屋久島紫薇愈傷組織增殖的影響

將愈傷組織進(jìn)行分割后，在增殖培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。由表2可以看出,60 d后增殖倍數(shù)最高達(dá)3.1,且愈傷組織生長狀態(tài)良好。因此,屋久島紫薇愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA。

表2不同質(zhì)量濃度6-BA與NAA對屋久島紫薇愈傷組織增殖的影響

處理6-BA/(mg/L)NAA/(mg/L)增殖倍數(shù)110.052210.12.831.50.052.541.50.13.1

2.3 不同質(zhì)量濃度6-BA與IBA對子葉愈傷分化的影響

以屋久島紫薇誘導(dǎo)的愈傷組織為材料,6-BA與IBA的不同質(zhì)量濃度組合,進(jìn)行愈傷組織分化的研究。由表3可以看出來,6-BA與IBA質(zhì)量濃度分別為1.0,0.5 mg/L條件下,愈傷組織的分化率達(dá)最高值18.7%,愈傷組織不定芽的分化數(shù)也較高,小苗的生長狀況良好,未發(fā)生玻璃化現(xiàn)象。因此,誘導(dǎo)屋久島紫薇愈傷組織分化的最適培養(yǎng)基為WPM+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA,分化情況如圖2。

圖2 屋久島紫薇子葉愈傷組織分化情況

處理6-BA/(mg/L)IBA/(mg/L)分化率/%平均不定芽數(shù)/個生長狀況11.00.210.5±2.33.7±0.7生長良好21.00.518.7±3.95.1±1.2生長良好32.00.225.1±3.23.2±0.5玻璃化42.00.522.3±2.84.5±1.1玻璃化

2.4 移栽基質(zhì)對屋久島紫薇組織培養(yǎng)苗移栽的影響

由表4可以看出,3種基質(zhì)中珍珠巖處理的屋久島紫薇組織培養(yǎng)苗的移栽成活率僅有52%,且生根率最低,這可能是由于純珍珠巖基質(zhì)蓬松，透水性好,容易失水,不利于組織培養(yǎng)苗的移栽成活;泥炭土的移栽成活率為84%,該處理的生根率較低,可能是由于泥炭土透氣性稍差;以等容積的泥炭土+珍珠巖混合物處理，屋久島紫薇組織培養(yǎng)苗的移栽成活率最高達(dá)90%,且該處理的組織培養(yǎng)苗長勢較好,生根好,這可能是由于泥炭土與珍珠巖特性互補(bǔ)。因此,屋久島紫薇組織培養(yǎng)苗最適的移栽基質(zhì)為等容積的泥炭土+珍珠巖混合物。

表4 基質(zhì)對屋久島紫薇組織培養(yǎng)苗移栽的影響

3 討論

屋久島紫薇組織培養(yǎng)的成功,與培養(yǎng)基,激素配比,外植體的情況都息息相關(guān)。宋平以紫薇叢生芽的葉片為外植體誘導(dǎo)愈傷組織,誘導(dǎo)率較普通紫薇材料高。植物激素在植物可塑性發(fā)育中起著很重要的作用[10]。屋久島紫薇在添加了較高質(zhì)量濃度為2,4-D的誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基中,愈傷組織的狀態(tài)為白色疏松的狀態(tài),這種狀態(tài)的愈傷組織生命力弱,不利于后續(xù)的分化步驟,這可能由于2,4-D對植物組織有一定的毒害作用[11]。在組織培養(yǎng)試驗中,細(xì)胞分裂素可以促進(jìn)芽的形成與生長[12-14],所以本試驗設(shè)計了不同質(zhì)量濃度的生長調(diào)節(jié)劑組合,對屋久島紫薇愈傷組織的誘導(dǎo),組織培養(yǎng)苗的增殖,愈傷組織的分化進(jìn)行研究,結(jié)果表明,屋久島紫薇子葉愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2,4-D,組織培養(yǎng)苗繁殖的最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA,愈傷組織的分化的最適培養(yǎng)基為WPM+1.0 mg/L 6-BA 1.0+0.5 mg/L IBA。

隨著生物技術(shù)的不斷進(jìn)步,分子植物育種將廣泛用于觀賞植物的花色、花型、香氣、葉色、株型等基因的遺傳改良,屋久島紫薇組織培養(yǎng)再生體系的建立,為其奠定基礎(chǔ),豐富我國的紫薇品種。