MicroRNA-486和TGF-β1對人主動(dòng)脈瓣膜鈣化的影響及其機(jī)制研究*

（上海健康醫(yī)學(xué)院附屬周浦醫(yī)院，上海 201318）

近年來，全球鈣化性主動(dòng)脈瓣疾?。╟alcific aortic valve disease, CAVD）的發(fā)病率不斷上升，成為老齡人最常見的心臟瓣膜疾病之一[1-3]。最新研究提示，多種microRNA（miRNA）在主動(dòng)脈瓣鈣化及瓣膜內(nèi)異位骨化中起重要調(diào)控作用[4]，國外學(xué)者HEATH等[5]亦在研究中闡述了miRNA與CAVD的聯(lián)系。但筆者查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)miRNA-486與CAVD的研究較少，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)其多數(shù)功能作用與轉(zhuǎn)錄生長因子-β1（transcription growth factor-β1, TGF-β1）相關(guān)，為 CAVD進(jìn)程中的靶基因及作用機(jī)制仍未明確[3-5]。因此，本研究擬通過轉(zhuǎn)染miRNA-486模擬物和抑制物，進(jìn)一步驗(yàn)證其作用，以期為CAVD的治療尋找一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要材料及儀器

1.1.1 細(xì)胞及試劑 人主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞（human aortic valve interstitial cells, VICs）由上海健康醫(yī)學(xué)院附屬周浦醫(yī)院提供，維生素C、地塞米松、β-甘油磷酸、茜素紅購自美國Sigma生物公司，膠原酶、SMAD3抗體、TGF-β1抗體購自杭州遠(yuǎn)方生物科技有限公司，高糖DMEM培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素、10%胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibco公司。

1.1.2 主要儀器 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRTPCR）儀（ABI7900HT）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Applied Biosystems公司，日本Olympus FV1000激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司），Eppendorf基因擴(kuò)增儀、Leica倒置熒光相差顯微圖像系統(tǒng)、組織切片機(jī)、組織包埋機(jī)購自上海賽默飛世爾科技有限公司，多功能酶標(biāo)儀則（美國BioTek公司），Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)（美國LICOR公司），免疫熒光試劑包括多聚甲醛、Triton X-100、BSA、PBS、DAPI、抗淬滅封片劑購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，核酸蛋白電泳設(shè)備（上海生工生物工程股份有限公司），各種離心及冷藏設(shè)備（低溫冰箱和液氮罐）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用膠原酶溶解人主動(dòng)脈瓣組織后，刮取內(nèi)皮細(xì)胞層再次溶解制成細(xì)胞懸液。常規(guī)培養(yǎng)于高糖DMEM培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清、100μg/ml青霉素和鏈霉素，控制培養(yǎng)箱條件為37℃、5%二氧化碳CO2恒溫。密切觀察12 h后改用鈣化培養(yǎng)基（含10 nmol/L地塞米松、50 mg/L維生素C和10 mmol/L β-甘油磷酸鈉）培養(yǎng)細(xì)胞，觀察兩組細(xì)胞狀態(tài)，每隔2天更換培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞生長至70%～80%時(shí)，胰蛋白酶消化傳代，取傳代后3～7代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測 初步應(yīng)用TargetScan 6.2版本等生物信息學(xué)軟件檢索miRNA-486靶基因，結(jié)果顯示TGF-β1基因可能是其潛在靶基因。收集第3代VIC細(xì)胞按1×106個(gè)/孔接種于6孔板，利用PCR法獲取VIC細(xì)胞中的cDNA模板，構(gòu)建包含miRNA-486結(jié)合位點(diǎn)TGF-β1基因3’-UTR的序列，插入pMIR-REPORT luciferase報(bào)告載體中，經(jīng)限制性內(nèi)切酶處理后，純化鑒定。構(gòu)建獲得的TGF-β1-WT（野生型）重組載體質(zhì)粒和TGF-β1-Mut（突變型）重組載體質(zhì)粒，所有構(gòu)建獲得的表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)酶切和測序鑒定。按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書進(jìn)行操作，將上述重組質(zhì)粒載體和miR-486 mimic、miR-486 mimic NC、miR-486 Inhibitors、miR-486 Inhibitors NC（美國Invitrogen公司合成）共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞（生長狀態(tài)良好），24 h后行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測。以熒光素為底物，檢測螢火蟲熒光素酶活性，加入Stop&Glo8試劑，檢測海腎熒光素酶活性，以海腎熒光素酶活性作為內(nèi)參照，同時(shí)加入抑制熒光素酶催化熒光素發(fā)光的物質(zhì)，計(jì)算各組細(xì)胞內(nèi)的相對熒光素酶活性。熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。實(shí)驗(yàn)操作重復(fù)3次。

1.2.3 miRNA-486轉(zhuǎn)染及分組 分別將miR-486 mimics、miR-486 mimics NC、miR-486 mimic Inhibitors、miR-486 mimic Inhibitors NC通過Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染第3代VICs細(xì)胞，分為4組。PBS洗滌3次后，各組按量加入DEPC處理的水，輕蕩混勻。調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)，在500μl無血清、無雙抗的轉(zhuǎn)染專用opti-MEM培養(yǎng)基中加入Lipofectamine 2000，作用5 min。輕輕吹打，室溫靜置20 min。棄培養(yǎng)皿中細(xì)胞上清樣，配成0.5 ml轉(zhuǎn)染液，PBS清洗培養(yǎng)皿中細(xì)胞2次，加入無血清的1.5 ml opti-MEM。放入培養(yǎng)箱孵育6 h，棄轉(zhuǎn)染液，PBS洗1次，加入成骨誘導(dǎo)液繼續(xù)孵育。

1.2.4 Western blot檢測 采用Western blot檢測內(nèi)源性TGF-β1蛋白表達(dá)水平。選取第3代細(xì)胞，轉(zhuǎn)染miRNA并成骨誘導(dǎo)后第7天，取6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，PBS清洗2次，1 200 r/min離心5 min，棄上清液，加入細(xì)胞裂解液，搖勻，靜置20 min。4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液置于新的離心管中。用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒進(jìn)行蛋白定量，樣品按量加入96孔的蛋白標(biāo)準(zhǔn)孔，再加入200μl BCA工作液，反應(yīng)30 min，SDS-PAGE（8%分離膠，5%濃縮膠）凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1.5 h后分別加入TGF-β1抗體稀釋液（1∶1 000），4℃過夜孵育，TBS洗膜3次，5 min/次。室溫下加入1∶3 000的二抗稀釋液（辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG）孵育1.5 h，TBS洗3次。

1.2.5 茜紅素染色 沉積的鈣可與茜素紅發(fā)生顯色反應(yīng)，細(xì)胞外基質(zhì)被染成橘紅色，而細(xì)胞本身被染成粉紅色。用100 ml蒸餾水溶解1 g Tris，滴管緩慢滴加HCl到溶液中，觀察溶液酸堿度，當(dāng)pH=8.3時(shí)，向溶液中加入0.1 g茜紅素粉末，配置為pH=8.3的0.1%茜素紅-Tris-HCl工作液。同時(shí)，取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，在100倍倒置顯微鏡下觀察消化后細(xì)胞的形態(tài)變化，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，24孔板加入爬片，細(xì)胞2萬個(gè)/孔；貼壁加入PBS清洗2遍，95%乙醇固定。10 min后，雙蒸餾水清洗3次，加入配置好的工作液，37℃恒溫作用30 min。將茜素紅染液用0.22μm濾紙過濾，加入染液覆蓋住底孔，室溫染色放置5 min，PBS漂洗3次，風(fēng)干，甘油明膠封片，倒置顯微鏡觀察鈣結(jié)節(jié)染色情況，橘紅色礦化結(jié)節(jié)為陽性結(jié)果。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，在加入成骨誘導(dǎo)液7和14 d時(shí)進(jìn)行染色；每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每樣本隨機(jī)取1個(gè)視野，比較各組間差異。

1.2.6 堿性磷酸酶活性測定 PNPP制備：5.4 ml Assay Buffer溶解2片PNPP，制成5 mmol工作液。ALP酶制備：1 ml Assay Buffer 加入ALP酶。取160μl Assay Buffer混入40μl PNPP制成1 mmol標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)孔中每個(gè)梯度加入0、4、8、12、16和20μl Assay Buffer，吹打搖勻后孵育5 min，加入10μl ALP酶。清洗轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，加入50μl Assay Buffer，13 000 r/min離心3 min。取20μl樣品，加入Assay Buffer至80μl，加入50μl/孔 PNPP反應(yīng)液50μl，25℃避光作用60 min，加入20μl終止液混勻，于405 nm處測定吸光度值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算ALP活性。

1.2.7 qRT-PCR 采用 qRT-PCR 檢測 TGF-β1、SMAD3，以及成骨相關(guān)因子RUNX2、骨鈣素。選取第3代細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染后24 h、2 d和7 d，檢測各組細(xì)胞TGF-β1、SMAD3、RUNX2及骨鈣素mRNA相對表達(dá)量。棄用培養(yǎng)基后，PBS清洗細(xì)胞3次，加入Trizol試劑，裂解細(xì)胞。反復(fù)吹打后，將裂解液轉(zhuǎn)移至無RNA酶的離心管中，振蕩離心10 min，取上清液。將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中（無RNA酶），加入氯仿，反復(fù)震蕩，靜置10 min，11 200 r/min離心，待樣品分層后取上清，同時(shí)加入等體積異丙醇，混勻后低溫過夜。次日取出，溶解后離心10 min，收集沉淀，用75%乙醇（DEPC溶解）清洗搖勻，棄上清，風(fēng)干，取2μl總RNA溶解液稀釋。引物長度18～22 bp，TGF-β1、SMAD3、RUNX2、骨鈣素?cái)U(kuò)增片段長度分別為185、224、233和202 bp以GAPDH為內(nèi)參，檢測各目的基因的Ct值，采用公式2-△△CT計(jì)算各目的基因的相對表達(dá)量，操作重復(fù)3次，內(nèi)參基因及目的基因引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.8 免疫熒光 采用免疫熒光檢測各組TGF-β1、RUNX2蛋白相對表達(dá)量。各組細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后第14天，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗2、3次，4%多聚甲醛固定1 h，0.01 mol PBS浸洗3次，3 min/次。采用0.1% Triton X-100透膜作用15 min，0.01 mol PBS浸洗3次；1% BSA-PBS封閉，傾去，滴加稀釋后的一抗（1∶100），放入濕盒中4℃避光過夜。次日拿出，棄一抗，0.01 mol PBS沖洗3次，滴加對應(yīng)熒光標(biāo)記二抗（1% BSA-PBS以1∶100比例稀釋），37℃孵育30 min，棄二抗，PBS沖洗后用DAPI復(fù)染細(xì)胞核，染色約20 min，PBS沖洗3次，3 min/次?？勾銣绶馄瑒┓馄瑹晒怙@微鏡下觀察并拍照記錄。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1是miRNA-486的直接靶基因

熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示，miR-486 mimic、miR-486 mimic NC組、miR-486 mimic組及miR-486 mimic NC組比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.052，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗(yàn)，miR-486 mimic+TGF-β1-WT共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的熒光素酶活性強(qiáng)度低于miR-486 mimic NC組（P＜0.05）。進(jìn)一步轉(zhuǎn)染miR-486 Inhibitors+TGF-β1-WT、miR-486 Inhibitors NC+TGF-β1-WT、miR-486 Inhibitors+TGF-β1-Mut和 miR-486 Inhibitors NC+TGF-β1-Mut至293T細(xì)胞，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.006，P=0.003）；miR-486 Inhibitors +TGF-β1-WT共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的熒光素酶活性強(qiáng)度高于miR-486 Inhibitors NC+TGF-β1-WT共 轉(zhuǎn) 染 組（P＜0.05）。 見 表 2和圖1。

表2 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果 （±s）

表2 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果 （±s）

注：1）與miR-486 mimic NC組比較，P ＜0.05；2）與miR-486 Inhibitors NC組比較，P ＜0.05

組別 TGF-β1-WT TGF-β1-Mut miR-486 mimic組 0.56±0.031） 1.13±0.06 miR-486 mimic NC 組 1.00±0.05 1.17±0.07 miR-486 Inhibitors組 1.30±0.032） 1.29±0.09 miR-486 Inhibitors NC 組 0.64±0.02 1.33±0.06

圖1 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果比較 （±s）

2.2 miRNA-486對內(nèi)源性TGF-β1蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測顯示，miR-486 mimic組、miR-486 mimic NC組、miR-486 Inhibitors組、miR-486 Inhibitors NC組的TGF-β1蛋白相對表達(dá)量分別為（87.31±3.11）、（103.34±4.38）、（118.15±3.46）和（106.07±4.57），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.148，P=0.028）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗(yàn)，miR-486 mimic組TGF-β1蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；miR-486 Inhibitors組 TGF-β1蛋白水平較miR-486 Inhibitors NC 組升高（P＜0.05）。見圖 2。

圖2 各組TGF-β1蛋白的表達(dá)水平比較 （±s）

2.3 各組鈣鹽沉積情況

茜素紅染色結(jié)果顯示，miR-486轉(zhuǎn)染后，培養(yǎng)第14天時(shí)，miR-486 mimic NC組可見著色小點(diǎn)形成，少量橘紅色沉淀；miR-486 mimic組可見大量橘紅色鈣鹽沉積；miR-486 Inhibitors NC組橘紅色沉淀較少；miR-486 Inhibitors組鈣鹽沉積減少。見圖3。

2.4 各組ALP活性比較

miR-486 mimic組、miR-486 mimic NC組、miR-486 Inhibitors組、miR-486 Inhibitors NC組ALP活性分 別 為（6.23±0.31）、（3.96±0.22）、（2.07±0.14）和（4.15±0.27）mmol/（min·mg），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.361，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗(yàn)，miR-486 mimic組ALP活性高 于 miR-486 mimic NC組（P＜0.05）；與 miR-486 Inhibitors NC組比，miR-486 Inhibitors組ALP活性下 降（P＜0.05）；miR-486 Inhibitors NC 組 與 miR-486 mimic NC組ALP活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；miR-486 mimic組ALP活性高于miR-486 Inhibitors組（P＜0.05）。見圖 4。

圖3 各組miR-486轉(zhuǎn)染后14 d鈣鹽沉積情況 （茜素紅染色×100）

圖4 各組成骨誘導(dǎo)14 d后ALP活性比較 （±s）

2.5 各組TGF-β1、SMAD3、RUNX2及骨鈣素mRNA表達(dá)水平

miR-486 mimic組、miR-486 mimic NC組、miR-486 Inhibitors 組、miR-486 Inhibitors NC 組 TGF-β1、SMAD3、RUNX2及骨鈣素mRNA水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗(yàn)，miR-486 mimic組TGF-β1和SMAD3 mRNA表達(dá)水平低于miR-486 mimic NC組（P＜0.05），Runx2和 骨 鈣 素 mRNA 高 于 miR-486 mimic NC 組（P＜0.05）；miR-486 Inhibitors組TGF-β1和SMAD3 mRNA表達(dá)水平高于miR-486 Inhibitors NC組（P＜0.05），RUNX2和骨鈣素mRNA低于miR-486 Inhibitorsost NC組（P＜0.05）；miR-486 mimic NC組與miR-486 Inhibitors NC組各mRNA表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3和圖5。

表3 各組TGF-β1、SMAD3、RUNX2及骨鈣素mRNA表達(dá)水平比較 （±s）

表3 各組TGF-β1、SMAD3、RUNX2及骨鈣素mRNA表達(dá)水平比較 （±s）

注：1）與miR-486 mimic NC組比較，P ＜0.05；2）與miR-486 Inhibitors NC組比較，P ＜0.05

組別 TGF-β1 SMAD3 RUNX2 骨鈣素miR-486 mimic NC 組 1.07±0.06 0.94±0.05 1.36±0.01 0.86±0.03 miR-486 mimic 組 0.68±0.041） 0.57±0.071） 1.5±0.021） 1.39±0.021）miR-486 Inhibitors NC組 1.12±0.05 1.06±0.06 1.44±0.03 0.79±0.03 miR-486 Inhibitors 組 1.45±0.042） 1.33±0.052） 1.15±0.012） 0.62±0.022）F值 4.327 5.378 3.805 3.524 P值 0.001 0.000 0.011 0.016

圖5 各組TGF-β1、SMAD3、RUNX2及骨鈣素mRNA表達(dá)水平比較 （±s）

2.6 各組TGF-β1、SMAD3、RUNX2的蛋白表達(dá)

培養(yǎng)14 d后經(jīng)免疫熒光檢測，對比miR-486 mimic組、miR-486 mimic NC組、miR-486 Inhibitors組、miR-486 Inhibitors NC組RUNX2蛋白表達(dá)水平，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗(yàn)，miR-486 mimic組Runx2蛋白表達(dá)水平高于miR-486 mimic NC組，熒光增強(qiáng)（P＜0.05）；miR-486 Inhibitors組較miR-486 Inhibitors NC組熒光強(qiáng)度降低，僅表達(dá)少量RUNX2蛋白（P＜0.05）。各組TGF-β1和SMAD3蛋白表達(dá)水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗(yàn)，miR-486 mimic組TGF-β1、SMAD3蛋白表達(dá)水平低于miR-486 mimic NC組，熒光強(qiáng)度降低（P＜0.05）；而轉(zhuǎn)染miR-486 Inhibitors后，miR-486 Inhibitors組 TGF-β1、SMAD3熒光強(qiáng)度增加，蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。見表4和圖 6、7。

表4 各組TGF-β1、SMAD3、RUNX2蛋白表達(dá)水平比較 （±s）

表4 各組TGF-β1、SMAD3、RUNX2蛋白表達(dá)水平比較 （±s）

注：1）與miR-486 mimic NC組比較，P ＜0.05；2）與miR-486 Inhibitors NC組比較，P ＜0.05

組別 RUNX2 SMAD3 TGF-β1 miR-486 mimic 組 103±3.721） 62±4.461） 71±2.641）miR-486 mimic NC 組 81±4.84 78±5.57 92±3.25 miR-486 Inhibitors NC組 76±4.66 85±4.38 89±3.03 miR-486 Inhibitors組 54±3.692） 109±4.112） 113±2.912）F值 7.009 9.713 3.962 P值 0.000 0.000 0.008

圖6 各組TGF-β1、Smad3、Runx2蛋白免疫熒光強(qiáng)度

圖7 各組TGF-β1、SMAD3、RUNX2蛋白表達(dá)水平比較 （±s）

3 討論

CAVD發(fā)病率隨年齡增長而升高，是一種常見的老年慢性疾病，病情呈緩慢進(jìn)展趨勢。到中晚期時(shí)，CAVD可顯著增高心肌梗死發(fā)生率、心血管死亡率[6-7]；盡管經(jīng)導(dǎo)管主動(dòng)脈瓣置換術(shù)治療主動(dòng)脈瓣狹窄已取得一定成效，但是在減緩CAVD發(fā)生、阻止病情進(jìn)展上仍未達(dá)到預(yù)想效果。主動(dòng)脈瓣鈣化到主動(dòng)脈瓣狹窄是一個(gè)相對漫長的過程，可研究的作用因子較多，病情延緩可依靠持續(xù)的藥物作用，因而藥物的早期干預(yù)已成為當(dāng)前臨床治療CAVD的目標(biāo)之一[8]，而尋找與CAVD相關(guān)的靶基因則是研究新型有效藥物的方向之一。目前，已有研究在鈣化性主動(dòng)脈瓣狹窄動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)某些microRNA變化與異位骨化、炎癥細(xì)胞激活等現(xiàn)象相關(guān)[9]。國外學(xué)者OHUKAINEN等[10]通過體外培養(yǎng)的人THP-1巨噬細(xì)胞，檢測microRNA靶預(yù)測數(shù)據(jù)庫與瓣膜microRNA表達(dá)譜結(jié)合度，證實(shí)micro125b、趨化因子CCL4的水平含量與CAVD關(guān)系密切。盡管證實(shí)多種microRNA具有調(diào)控發(fā)育、增殖、凋亡、代謝和免疫等多方面的生物學(xué)作用[11]，但其參與調(diào)控CAVD的作用及可能機(jī)制仍屬于國內(nèi)較新的研究。

TGF-β在炎癥、組織修復(fù)及胚胎發(fā)育等方面有不可或缺的調(diào)控作用，其主要類型分為TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3，其中TGF-β1在細(xì)胞和組織中含量較為豐富，其調(diào)控的信號通路多為Smads通路，可結(jié)合受體TβRII使SMAD2和SMAD3磷酸化，進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄[12]。在本研究中，雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)結(jié)果顯示，miR-486 mimic+TGF-β1-WT共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性強(qiáng)度降低，而miR-486 Inhibitors+TGF-β1-WT共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的熒光素酶活性強(qiáng)度升高，對照組間無差異，這提示TGF-β1可能是miR-486的直接靶基因。筆者采用Western blot檢測miR-486 mimic、miR-486 Inhibitors轉(zhuǎn)染后，鈣化性VICs細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)差異，結(jié)果提示與各對照組相比，miR-486 mimic組TGF-β1較低，miR-486 Inhibitors組則相反。以上結(jié)果進(jìn)一步證明TGF-β1可能是miR-486的靶基因，miR-486的某些作用與TGF-β1存在密切聯(lián)系。學(xué)者M(jìn)ARTíNEZ-MICAELO等[13]認(rèn)為，miR-486與miR-718在主動(dòng)脈瓣疾病的發(fā)生中扮演重要角色，其靶基因可能是TGF-β1、RUNX2，與本研究結(jié)論一致。

茜素紅染色可顯示成骨細(xì)胞培養(yǎng)中礦化結(jié)節(jié)的數(shù)量、大小及形態(tài)，實(shí)驗(yàn)中觀察到的深紅色帶色化合物即為茜素紅與鈣結(jié)合而成的顯色物質(zhì)，常用于判斷體外誘導(dǎo)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化程度的高低及成骨活性的大小[14]。在本實(shí)驗(yàn)中，對鈣化培養(yǎng)14 d后的各組細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色，結(jié)果顯示，miR-486 mimic組可見大量橘紅色鈣鹽沉積；miR-486 Inhibitors組鈣鹽沉積減少，提示miR-486可能具有促使VICs細(xì)胞成骨分化的作用，可加速細(xì)胞鈣化。堿性磷酸酶作為成骨細(xì)胞和骨組織的標(biāo)志物，在主動(dòng)脈鈣化瓣膜及體外培養(yǎng)細(xì)胞成骨分化后，其表達(dá)增強(qiáng)，含量升高。在ALP實(shí)驗(yàn)中，可發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-486 mimic后細(xì)胞ALP活性增加，而miR-486 Inhibitors轉(zhuǎn)染后卻降低，此現(xiàn)象提示，miR-486能增強(qiáng)VICs細(xì)胞中ALP的活性，即能促進(jìn)VICs細(xì)胞鈣化。

RUNX2是骨發(fā)生過程中調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化至成熟的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，亦是成骨細(xì)胞特異轉(zhuǎn)錄因子，在大部分CAVD患者細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)，常作為骨代謝狀態(tài)的一種檢測指標(biāo)[15]。SMAD3作為TGF-β1的下游因子，聯(lián)合TGF-β1形成TGF-β1-SMAD3信號通路可介導(dǎo)多種生理反應(yīng)，作用廣泛。本研究采用qRT-PCR和免疫熒光檢測各組成骨相關(guān)因子及可能信號通路中基因的表達(dá)含量。結(jié)果提示，TGF-β1、SMAD3 mRNA和蛋白水平在miR-486 mimic組降低，在miR-486 Inhibitors組中升高，對照組無差異；miR-486 mimic組RUNX2、骨鈣素mRNA水平較高，miR-486 Inhibitors組降低，且RUNX2蛋白在miR-486 mimic組表達(dá)較高；上述現(xiàn)象均提示miR-486能下調(diào)TGF-β1的表達(dá)，可能通過TGF-β1-SMAD3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)RUNX2、骨鈣素的表達(dá)和活性，誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，發(fā)生異位骨化。

本研究尚有不足，TGF-β1介導(dǎo)的信號通路較復(fù)雜，未能進(jìn)行深入討論；成骨分化相關(guān)因子較多，本研究納入較局限。筆者將在以后的研究中，增加實(shí)驗(yàn)類型與難度，進(jìn)一步探討TGF-β1下游因子在CAVD進(jìn)展中的作用，納入更多成骨分化相關(guān)因子，以證實(shí)該結(jié)論。

綜上所述，本研究通過轉(zhuǎn)染miR-486模擬物及抑制物，參照各對照組，分析其對VICs細(xì)胞成骨分化的影響及可能的作用機(jī)制，證實(shí)miR-486的靶基因可能為TGF-β1，其可促進(jìn)VICs細(xì)胞成骨分化。