煙霧對支氣管哮喘大鼠肺組織激活素A表達的影響

（徐州醫(yī)科大學，江蘇 徐州 221004）

支氣管哮喘（以下簡稱哮喘）是一種以慢性氣道炎癥為特征的異質(zhì)性疾病，涉及多種細胞及其組分。香煙煙霧是哮喘的促發(fā)因素之一，可以改變哮喘患者氣道炎癥特點，加重氣道重塑，降低激素治療的反應性。激活素A（activin A, ActA）是一種多效性細胞因子，屬于轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β,TGF-β）家族中一員。ActA可以刺激多種炎癥介質(zhì)，如IL-1β、IL-6、IL-13、TNF、一氧化氮NO等的產(chǎn)生，促進氣道平滑肌細胞和成纖維細胞增殖，增強氣道炎癥和氣道重塑[1]，在哮喘的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。本研究通過復制煙霧暴露的急性哮喘大鼠模型，觀察煙霧刺激對致敏大鼠肺組織ActA mRNA和蛋白表達的影響，探討煙霧暴露哮喘大鼠的氣道炎癥特點，為吸煙哮喘患者尋找新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SD大鼠32只，6～8周齡，體重（180±20）g，由徐州醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2 主要儀器和試劑

卵白蛋白（ovalbumin, OVA）（美國Sigma公司），廬山牌香煙（煙堿0.8 mg，焦油量11 mg），小鼠抗大鼠ActA抗體（美國Abcam公司），RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Trizol總RNA提取試劑盒、SYBRGreen購自北京天根生物技術(shù)有限公司，便攜式霧化器（江蘇魚躍醫(yī)療設備有限公司），光學顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 模型復制及實驗分組

32只雄性SD大鼠隨機分為正常對照組、煙霧對照組、哮喘模型組及煙霧哮喘組，每組8只。參照文獻[2]復制哮喘大鼠模型：分別于第1和8天給予大鼠腹腔注射10% OVA和Al（OH）3混合液1 ml[含OVA 1 g，Al（OH）3100 mg]致敏；第15天開始霧化吸入2% OVA溶液，60 ml/次，1次/d，中等霧量，40 min/次，共4周。正常對照組：腹腔注射生理鹽水1 ml代替OVA，第15天開始霧化吸入生理鹽水，60 ml/次，1次/d，共4周。煙霧對照組：前期復制同正常對照組，從第15天起，生理鹽水霧化30 min后，參照文獻[3]自制半封閉煙熏箱，每次點燃2支香煙燃燒8 min，休息5 min后再點燃2支，共10支，1次/d，共4周。煙霧哮喘組：前期復制同哮喘模型組，每日霧化OVA 30 min后，繼續(xù)按煙霧對照組處理方法復制煙霧模型，共4周。

1.4 標本制備

末次霧化誘發(fā)哮喘24 h后，以1%水合氯醛（400 mg/kg）腹腔注射麻醉，腹主動脈放血處死大鼠，完全游離心、肺組織，取左肺上葉組織，于4%多聚甲醛溶液中浸潤固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片，用于蘇木精-伊紅染色。取右肺上葉組織放入DEPC處理過的凍存管中，放于-80℃冰箱凍存用于實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR），其余肺組織迅速放入生理鹽水中，洗去血漬，保存于-80℃冰箱中用于Western blot檢測。

1.5 qRT-PCR

按照Trizol總RNA提取試劑盒說明書進行操作，提取肺組織中總RNA，檢測RNA濃度和鑒定RNA質(zhì)量。取1μg總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成互補脫氧核糖核酸（cDNA），反應體系為1μl cDNA，1μl ActA引物（見表1），10μl 2×SYBR PCR，8μl ddH2O。反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s，共40個循環(huán)，采集熒光信號。并自60～99℃緩慢升溫進行熔解曲線繪制。結(jié)果以PCR反應指數(shù)增長初期熒光信號跨越閾值時的反應循環(huán)數(shù)（Ct值）表示，ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt正常對照組，最后根據(jù)公式2-ΔΔCt計算實驗組目的基因ActA的相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6 Western blot檢測

收集不同處理組的肺組織，研磨后加入RIPA蛋白裂解液，冰上緩慢裂解20 min，4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清，用BCA蛋白濃度測定試劑盒對提取的總蛋白進行蛋白定量。取80μg總蛋白上樣，電泳結(jié)束后電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗（小鼠抗大鼠ActA，1∶1 000稀釋）4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，二抗（HRP標記的山羊抗小鼠IgG，1∶5 000稀釋）室溫孵育1 h，TBST洗滌3次后ECL顯影。采用Image J掃描蛋白灰度值，以ActA蛋白與GAPDH蛋白的灰度值比值作為目的蛋白的表達水平，以正常對照組目的蛋白灰度值與不同處理組目的蛋白灰度值的比值為統(tǒng)計指標，做柱狀圖。

1.7 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件和GraphPad Prism軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為改變

正常對照組大鼠毛發(fā)白亮細密，精神狀態(tài)良好，未見哮喘樣發(fā)作。煙霧對照組大鼠活動減少，毛發(fā)黃澀無光澤，未見哮喘發(fā)生。哮喘模型組毛發(fā)白暗稀疏，于霧化激發(fā)后，表現(xiàn)出煩躁不安、呼吸頻率加快、站立不穩(wěn)等行為。煙霧哮喘組除上述表現(xiàn)外，精神萎靡，毛發(fā)黃澀稀疏，喘息癥狀更為嚴重，呼吸明顯加重，頻率加快。

2.2 各組大鼠肺組織病理學改變

正常對照組大鼠支氣管管腔規(guī)則，纖毛排列整齊，肺泡及細支氣管形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常，血管腔、肺泡腔、肺間質(zhì)未見炎癥細胞浸潤。煙霧對照組支氣管纖毛柱狀上皮細胞脫落或變性，氣道壁增厚，以中性粒細胞和淋巴細胞浸潤為主。哮喘模型組肺組織以淋巴細胞浸潤為主，可見大量嗜酸性粒細胞，部分氣道壁增厚，管腔狹窄。煙霧哮喘組大鼠肺泡腔不規(guī)則擴大，肺泡間隔變薄或斷裂，氣道壁增厚明顯，可見淋巴細胞、嗜酸粒細胞及中性粒細胞浸潤。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理學改變 （HE×100）

2.3 各組大鼠肺組織ActA mRNA表達水平

各組大鼠肺組織ActA mRNA表達水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，與煙霧對照組相比，煙霧哮喘組ActA mRNA表達升高（P＜0.05）；與哮喘模型組相比，煙霧哮喘組中ActA mRNA表達升高（P＜0.05）；哮喘模型組與煙霧對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表 2和圖 2。

2.4 各組大鼠肺組織ActA蛋白表達水平

4組ActA蛋白表達水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，煙霧對照組與哮喘模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與煙霧對照組相比，煙霧哮喘組ActA蛋白表達升高（P＜0.05）；與哮喘模型組相比，煙霧哮喘組ActA蛋白表達升高（P＜0.05）。結(jié)果提示煙霧暴露可以提高大鼠肺組織中ActA的表達。見表2和圖3。

表2 各組大鼠肺組織ActA mRNA和蛋白表達水平比較（n =8，±s）

表2 各組大鼠肺組織ActA mRNA和蛋白表達水平比較（n =8，±s）

注：1）與正常對照組比較，P ＜0.05；2）與煙霧對照組、哮喘模型組比較，P ＜0.05

組別 ActA mRNA ActA蛋白正常對照組 0.996±0.039 1.067±0.446煙霧對照組 1.336±0.0491） 1.412±0.0371）哮喘模型組 1.487±0.0521） 1.591±0.0461）煙霧哮喘組 3.426±0.1051）2） 2.072±0.0731）2）F值 272.311 64.147 P值 0.000 0.000

圖2 各組大鼠肺組織ActA mRNA表達水平比較（n =8，±s）

圖3 各組大鼠肺組織ActA蛋白表達水平比較（n =8，±s）

3 討論

吸煙是哮喘發(fā)病的危險因素之一。哮喘患者的吸煙率約為20%，與普通人群的吸煙率非常接近[4]，但哮喘患者吸煙頻率可能更高[5]。煙霧暴露可以通過活化中性粒細胞和巨噬細胞，改變哮喘氣道炎癥特點，導致哮喘表型變化[6]。本實驗中，大鼠肺組織HE染色顯示煙霧暴露后哮喘大鼠氣道壁較哮喘模型組增厚，氣道周圍炎癥細胞浸潤更明顯，證實煙霧暴露可以加重和改變哮喘氣道原有的炎癥反應[7]。

本實驗分別復制哮喘和煙霧模型，模擬煙霧誘發(fā)、加重哮喘的過程，進一步探討煙霧對哮喘的影響。目前認為，理想的哮喘動物模型通常以出現(xiàn)典型哮喘樣發(fā)作、病理組織出現(xiàn)多種炎癥細胞浸潤（包括嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞）為特征。筆者在研究過程中觀察到，哮喘模型組、煙霧哮喘組大鼠于OVA霧化激發(fā)后出現(xiàn)不同程度煩躁不安、呼吸頻率加快、站立不穩(wěn)等哮喘發(fā)作癥狀，肺組織病理學也符合哮喘的主要特征，表明本實驗哮喘模型復制成功。本研究結(jié)果顯示，煙霧對照組和煙霧哮喘組大鼠毛色不同程度黃澀，精神萎靡；肺組織病理學結(jié)果顯示氣道周圍以中性粒細胞浸潤為主，提示煙霧模型復制成功。

ActA是最早在性腺中發(fā)現(xiàn)的由2個β亞基（βAβA）構(gòu)成的同型二聚體糖蛋白，調(diào)節(jié)多種生物學過程，包括免疫調(diào)節(jié)、組織修復、炎癥反應等。SAMITAS等[8]對57例無吸煙史成年人調(diào)查（包括16例健康人、19例持續(xù)輕中度哮喘患者和22例持續(xù)重癥哮喘患者）顯示，哮喘患者血清和肺泡灌洗液中ActA水平較正常對照組明顯升高，但是ActA受體蛋白（ALK-4和Act-RIIA）表達減少，特別是在重癥哮喘患者中。由此推斷，在哮喘氣道炎癥、肺組織及氣道上皮中，ActA表達水平的變化起非常重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，煙霧對照組和哮喘模型組大鼠肺組織ActA mRNA和蛋白表達水平較正常對照組升高，且煙霧哮喘組ActA mRNA和蛋白表達水平比煙霧對照組和哮喘模型組升高，氣道周圍炎癥細胞增多，氣道壁增厚，表明ActA參與哮喘氣道炎癥的病理過程，與上述研究結(jié)果一致。

香煙煙霧可以誘導氣道上皮表達ActA，促進Act-smad信號傳遞，向細胞內(nèi)傳遞目的基因，如TGF-β1、ActA等，而TGF-β1又加強ActA的表達，形成一個正反饋環(huán)。煙霧暴露可以刺激上皮細胞產(chǎn)生ActA，加重氣道炎癥反應，提示煙霧暴露參與ActA代謝過程[9]。但煙霧暴露對哮喘肺組織中ActA表達的影響有多大，目前尚不明確。本研究通過復制大鼠哮喘模型和煙霧模型，觀察煙霧暴露對OVA致敏的急性哮喘模型大鼠肺組織ActA mRNA和蛋白表達的影響，結(jié)果顯示，煙霧哮喘組ActA mRNA和蛋白表達水平高于哮喘模型組，提示香煙煙霧可以上調(diào)哮喘大鼠肺組織ActA mRNA和蛋白表達水平，加重氣道炎癥反應。結(jié)合既往研究，筆者推斷，香煙煙霧可以通過與氣道上皮細胞相互作用，產(chǎn)生大量ActA，進而釋放出多種炎癥介質(zhì)和細胞因子，促進哮喘氣道炎癥的發(fā)生[10]。本實驗中，煙霧對照組ActA蛋白表達水平與哮喘模型組無差異，煙霧哮喘組ActA蛋白表達水平與哮喘模型組有差異，證實香煙煙霧可以促進、加重哮喘的氣道炎癥反應。

通過基因敲除或使用ActA拮抗劑阻斷ActA信號傳遞通路可以進一步明確香煙煙霧、ActA與哮喘的關(guān)系，受工作量較大、費用較高等因素限制，只能在后續(xù)實驗中進一步完善。

綜上所述，吸煙可以促進致敏大鼠氣道ActA mRNA和蛋白的表達，產(chǎn)生、釋放多種炎癥介質(zhì)，加重哮喘氣道炎癥，但確切的作用機制仍需進一步研究。阻斷ActA信號傳遞很有可能是治療哮喘的一種有效方法，為哮喘的防治開辟了新的途徑。