高效液相色譜法測定甘蔗葉片中脫落酸

高欣欣，劉少春，刀靜梅，方志存，鄧軍，樊仙

（云南省農業(yè)科學院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室，云南 開遠661699）

甘蔗(Saccharum officinarum L.)是全球種植面積最大的糖料作物，約占世界產糖量的65%[1]。甘蔗具有高生物量和高纖維的特點，是重要的可再生能源作物。脫落酸（Abscisic acid,ABA)作為甘蔗生長發(fā)育的重要調節(jié)劑，在甘蔗出芽與分蘗、脫葉與成熟、病蟲害防治等方面具有重要作用[1－4]。因此，了解甘蔗內源ABA的變化規(guī)律，對于研究甘蔗宿根性和抗逆性，提高甘蔗產量和品質都具有重要意義。

植物內源ABA具有含量少、易分解、難提純等特點，目前應用在ABA上的檢測方法較多[5－8]，鑒于高效液相色譜法在靈敏度、重現(xiàn)性、精確度、選擇性等各個方面明顯優(yōu)于其它幾種檢測方法，現(xiàn)已被廣泛應用于多種植物內源ABA含量測定[9－13]，但是利用高效液相色譜測定甘蔗葉片中內源ABA尚未見相關報道。本試驗通過浸提、萃取、過柱等前處理方法對甘蔗葉片中內源ABA進行提純濃縮，并采用高效液相色譜法對其含量進行檢測鑒定，以期為研究甘蔗內源ABA的生理調控機制提供理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 材料、儀器及試劑

試驗樣品均采自云南省農業(yè)科學院甘蔗研究所試驗基地。

試驗品種為‘桂糖02－467’，于2016年2月種植，生長期田間管理與當?shù)馗收嵘a管理水平一致。2016年11月甘蔗進入成熟期后，于甘蔗成熟早期（11月25日）取甘蔗上部葉片－20℃保存，待用。

Waters e2695高效液相色譜儀，配紫外檢測器（美國沃特斯科技有限公司）；RE－52AA型旋轉蒸發(fā)儀（上海谷寧科技有限公司）；PS－100A超聲清洗器（深圳市超藝達科技有限公司）；DL－3010型低溫冷卻循環(huán)儀（上海谷寧科技有限公司）。ABA標準品（HPLC級，Sigma公司）；石油醚（分析純，天津光復科技發(fā)展有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，德國默克公司）；水（娃哈哈純凈水）。

1.2 標準溶液配制

利用甲醇溶液溶解適量ABA標準物質，得到標準液母液（質量濃度：1 000 mg/L）；取ABA標準液母液，利用甲醇溶劑逐級稀釋為0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L的標準溶液，各標準溶液4℃避光保存。

1.3 HPLC儀器條件

色譜柱：SunFireTM C18液相色譜柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：A 為甲醇，B 為 0.5%冰醋酸溶液（40∶60）；等度洗脫；流速：1.0 mL/min；進樣體積：10 μL；紫外全掃描圖譜，檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃。

1.4 樣品前處理

結合文獻[7－12]以及預實驗結果，甘蔗葉片前處理方法總結為：稱取甘蔗葉片樣品15 g，液氮研磨；4℃避光條件下，分別用甲醇和80%甲醇溶液80 mL轉移至150 mL磨口燒瓶中，重復2次，合并浸提液；40℃條件下，通過旋轉蒸發(fā)儀對浸提液進行減壓濃縮至無甲醇殘留后，利用30 mL石油醚脫色，重復3次；棄去醚相后過C18小柱對目標檢測物進一步提純，用20 mL 40%甲醇進行洗脫，收集洗脫液。1 mol/L鹽酸溶液調節(jié)洗脫液pH至3.0，并用3×30 mL乙酸乙酯進行萃取，此時ABA以分子形式存在，在乙酸乙酯中的溶解度遠大于在水相中的溶解度；合并乙酸乙酯萃取液過無水硫酸鈉進行干燥，并于40℃條件下減壓蒸干，殘渣進行甲醇溶解并定容至2 mL，過0.45 μm濾膜去除雜質后進樣，測量不同提取溶劑中ABA含量，確定最佳提取溶劑。

1.5 方法學考察

1.5.1 線性關系、檢出限和精密度 利用優(yōu)化后色譜條件，對質量濃度分別為0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L的標準溶液進行測定。繪制標準曲線，計算該方法的線性關系、檢出限和精密度。

1.5.2 加標回收實驗 取空白樣品和甘蔗葉片研磨樣品各3份，分別添加1 mg/L、2 mg/L和5 mg/L 3個不同濃度ABA標準溶液1 mL，按照優(yōu)化后的色譜條件和檢測方法測定ABA含量，計算回收率。

2 結果與分析

2.1 提取溶劑和提取時間的確定

根據(jù)甘蔗葉片樣品內源ABA的理化性質以及相關文獻報道，選擇甲醇和80%甲醇作為提取溶劑，分別比較浸提時間為 2 h、6 h、12 h、18 h、24 h 條件下樣品中ABA含量，各處理重復3次。試驗結果如表1所示，利用甲醇試劑浸提甘蔗葉片樣品，甘蔗葉片樣品中ABA含量遠高于80%甲醇浸提結果，表明甲醇對ABA的提取效果優(yōu)于80%甲醇。12 h時甘蔗葉片樣品ABA平均含量為200.8 μg/kg，達到最高峰，且隨提取時間加長，ABA含量呈遞減趨勢，因此選擇提取時間為12 h。在上述優(yōu)化實驗條件下，ABA的標準溶液和甘蔗葉片樣品色譜圖見圖1。

表1 不同溶劑不同浸提時間甘蔗葉片內源ABA含量

圖1 （a）ABA標準溶液及（b）甘蔗葉片樣品色譜圖

2.2 儀器色譜條件的選擇

2.2.1 流動相的選擇 在已報道的利用HPLC測定植物內源ABA的相關文獻中，流動相大多數(shù)采用甲醇－水體系進行等度洗脫的方法，本試驗在流動相中加入少量乙酸溶液，利用甲醇－水和甲醇－0.5%乙酸溶液兩個流動相進行實驗對比，結果表明，目標物與樣品均能較好地分離，但是甲醇－水體系色譜峰有較嚴重的拖尾現(xiàn)象，峰形較差。在流動相中加入少量乙酸溶液，可以明顯改善峰形，減少拖尾的同時提高響應值，因此選擇甲醇－0.5%乙酸溶液作為流動相。

2.2.2 柱溫的選擇 將柱溫分別設置為30、40、50℃，考察色譜柱溫度對甘蔗葉片樣品中各個組分分離的影響，發(fā)現(xiàn)柱溫每上升10℃，ABA保留時間提前約5 min，在3個柱溫條件下ABA均能較好地出峰，峰形尖銳，峰面積變化不大，說明柱溫對ABA的影響不顯著，因此，選擇30℃作為柱溫。

2.2.3 最大吸收波長的確定 將吸收波長分別設置為275 nm和254 nm，利用ABA標準溶液，進行紫外全掃描圖譜，確定ABA的最大吸收波長為254 nm。

2.3 方法學考察

在2.2優(yōu)化色譜條件下，對0.25～10.0 mg/L的標準溶液進行測定，以目標峰面積（y）對標準工作溶液的質量濃度（x）進行線性回歸，得到線性回歸方程y=34466x+7085，相關系數(shù)r2=0.996，說明ABA在0.25～10.0 mg/L范圍內具有良好的線性關系。將最低濃度的標準溶液平行測定10次，以3倍信噪比（S/N=3）對應的目標物濃度作為檢出限LOD=0.0202 mg/L，以S/N=10對應的目標物濃度作為定量限LOQ=0.0675 mg/L。

2.4 回收率

取空白樣品和甘蔗葉片樣品，每個處理重復3次，分別添加1 mg/L、2 mg/L和5 mg/L ABA標準溶液1 mL，按照2.2優(yōu)化后的色譜條件和檢測方法測定ABA含量，計算回收率。試驗結果如表2所示，ABA回收率為87.5%～102.4%，符合實驗要求。

表2 甘蔗葉片中ABA的回收率

2.5 實際樣品分析

利用2.1和2.2所建立的方法測定5個甘蔗葉片樣品（A、B、C、D、E、F）中內源ABA含量，每個樣品重復3次。從表3中可以看出，甘蔗葉片中ABA含量范圍為149.27～202.31 mg/kg，實現(xiàn)了甘蔗葉片樣品ABA含量的快速測定。

表3 實際甘蔗葉片中ABA的含量

3 結論

目前植物內源ABA檢測方法主要有毛細管電泳法（CE）[15]、酶聯(lián)免疫法（ELISA）[16]、氣相色譜法（GC）[17]等，但相較于HPLC檢測植物內源ABA含量，這些方法在準確定性、適用范圍、抗干擾能力等方面均存在不足，HPLC分析方法具有靈敏度高、選擇性好、抗干擾力強等優(yōu)點。

采用HPLC法測定甘蔗葉片中內源ABA含量，甘蔗葉片樣品液氮研磨后利用甲醇避光浸提，石油醚脫色，通過C18小柱和乙酸乙酯萃取對樣品中ABA進一步提純萃取。利用C18（5μm，200 mm×4.6 mm）不銹鋼柱分離，以甲醇－0.5%冰乙酸溶液（40∶60）為流動相，流速1 mL/min，柱溫30℃，在254 nm波長下檢測。在此條件下檢測甘蔗葉片中ABA含量，具有分離度高、峰形好、保留時間長等優(yōu)點。對該方法進行精確性、穩(wěn)定性和重復性試驗分析，結果表明，該方法前處理過程簡單，樣品中的ABA在0.25～10 mg/L范圍能呈現(xiàn)良好的線性關系（r2=0.996），加標回收率為87.5%～102.4%，相對標準偏差不大于5%，檢出限LOD=0.0202 mg/L，定量限LOQ=0.0675 mg/L。該方法靈敏度高、重復性好、回收率滿意，可應用于甘蔗葉片樣品中ABA的測定。