甜菜BvMARB基因全長(zhǎng)cDNA的克隆和序列分析

魯振強(qiáng) ，潘彥遙 ，王錦霞

（1.黑龍江省普通高等學(xué)校分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150500；2.黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱150080）

核基質(zhì)附著區(qū)結(jié)合蛋白 （matrix attachment regions binding proteins，MARB），在核基質(zhì)附著區(qū)（matrix attachment regions，MAR）有特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。首先，MAR廣泛分布于真核生物細(xì)胞核中，由非組蛋白的纖維蛋白和RNA組成，它在DNA的結(jié)構(gòu)、RNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、染色體的成分與結(jié)構(gòu)及減數(shù)分裂、基因表達(dá)調(diào)控等[1－3]中發(fā)揮重要作用。核基質(zhì)附著區(qū)功能的研究尤為關(guān)鍵，而MAR與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)之間的互作和細(xì)胞體的生理代謝路徑存在關(guān)聯(lián)，更多的研究證據(jù)表明，MAR及其特異性結(jié)合蛋白的關(guān)系更緊密。通過(guò)體外研究發(fā)現(xiàn)，某些關(guān)聯(lián)蛋白具有核基質(zhì)附著區(qū)特異結(jié)合能力和核基質(zhì)的骨架組分，那么這些MAR結(jié)合蛋白就是MAR與核基質(zhì)相互作用的實(shí)驗(yàn)證明。最新研究表明，來(lái)自于多種生物體內(nèi)MARB的成功分離，植物中的MARB首次從番茄中分離獲得，是一種核基質(zhì)附著區(qū)結(jié)合絲狀蛋白MFP1[4]，一種同工異構(gòu)型的MARB蛋白AHM1之后在小麥中被分離獲得[5]，小麥的AHM1屬于多體蛋白，包括有序列同源區(qū)、AT功能結(jié)合域以及鋅指拉鏈蛋白的結(jié)構(gòu)域，含有AT功能結(jié)合域的新型MARB的核蛋白AHL1后續(xù)又獲得[6]，它對(duì)核基質(zhì)和MAR的結(jié)合具特異性的耦合效應(yīng)。有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，核基質(zhì)附著區(qū)結(jié)合蛋白不但具備增強(qiáng)調(diào)節(jié)，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了其負(fù)向調(diào)控目的集合區(qū)域附近關(guān)聯(lián)的基因，其中包括一些反式作用因子，包括一些調(diào)節(jié)細(xì)胞程序化死亡的表達(dá)基因。例如p53、p21、C－myc及Bcl－2家族等。其中，p53與核基質(zhì)附著區(qū)的結(jié)合具有特異性、高親和性，這種結(jié)合增加了隨后DNA復(fù)制的突變[7]。另外，Bcl－2調(diào)控了促進(jìn)細(xì)胞程序化凋亡蛋白的表達(dá)，Bcl－2的MARs不僅與HL260細(xì)胞的MARB結(jié)合，還表現(xiàn)了與其功能密切相關(guān)性[8]。C－myc家族成員Bax是編碼了一種細(xì)胞程序化凋亡表達(dá)因子，C－myc編碼序列的功能區(qū)是一段長(zhǎng)度為33 bp的短肽，富含AT的核酸保守序列[9]，與MARB發(fā)生互作，參與細(xì)胞調(diào)控[10]。

從上世紀(jì)80年代開始，黑龍江大學(xué)甜菜科研團(tuán)隊(duì)，采用具有優(yōu)良遺傳資源的野生白花甜菜（Beta corolliflora Zoss）與普通栽培甜菜（Beta vulgaris）進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)，研究中發(fā)現(xiàn)了具有無(wú)融合生殖特性的單體附加系，最終獲得并鑒定命名了甜菜M14品系，在細(xì)胞胚胎學(xué)和遺傳學(xué)特征上具有鮮明的無(wú)融合生殖現(xiàn)象，是克隆無(wú)融合生殖基因極為難得的材料[11－12]。以往對(duì)植物生殖發(fā)育的研究主要以擬南芥、煙草等模式植物為材料，本次以甜菜M14品系為試材克隆了MARB基因的全長(zhǎng)cDNA序列，這不僅有助于甜菜優(yōu)良品種的選育研究，而且對(duì)于進(jìn)一步闡明植物生殖發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)理也具有重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

實(shí)驗(yàn)地在黑龍江大學(xué)，植物材料以甜菜（Beta vulgaris）單體附加系M14品系為試材。

主要試劑：TRIzol（InvitroGen）；cDNA反轉(zhuǎn)錄、PCR、RACE、T載體、膠回收等試劑盒購(gòu)于大連寶生物（Takara）；所用引物由上海生物工程公司合成；其他相關(guān)生化試劑純度級(jí)別為進(jìn)口分析純。

1.2 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄PCR

取1 g甜菜盛花期的花蕾，迅速置于液氮中，并置于－70℃冰箱保存?zhèn)溆?。TRIzol法提取甜菜的總RNA。根據(jù)其他物種的MARB基因核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，找出其高度同源的序列。設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物BvMARB－1和BvMARB－2（表 1）。取花蕾總 RNA 1 μg，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以 BvMARB－1 和 BvMARB－2 為引物，利用LA Taq進(jìn)行PCR擴(kuò)增。程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min，94℃變性50 s，55℃退火50 s，72℃延伸2 min，32個(gè)循環(huán)，72℃延伸12 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果。

1.3RACE

1.3.1 3′RACE 根據(jù)已克隆的MARB基因的保守片段和真核生物3′末端具有Poly尾的特性，利用PrimerPrimier 5.0設(shè)計(jì)3′RACE引物：BvMARB－3，M13 Primer M4（表1）。PCR反應(yīng)體系為：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物10 μL，25mmol/L MgCl23 μL，10×LA PCR Buffer II 4 μL，TaqTM 0.25 μL，M13 Primer M4 0.5 μL，BvMARB－3 Primer 0.5 μL。退火溫度為60℃，31個(gè)循環(huán)。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.2 5′RACE 根據(jù)已克隆的 3′RACE序列， 在其 5′末端設(shè)計(jì)兩組引物：BvMARB－GSP1、BvMARB－GSP2（表 1）。取 3 μg RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以 5′CDS 引物、SMART II A 為引物。70℃保溫 2 min，冰上冷卻 2 min，隨后加入 5×First－Strand buffer 2 μL，DTT 1 μL，10 mmol/L dNTPs 1μL，Reverse Transcriptase 1 μL，42℃反應(yīng) 1.5 h。 加入 TE（Tricine－EDTA）緩沖液 100 μL，72℃保溫 7 h。

以上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以10×UPM、GSP為引物，進(jìn)行降落PCR，程序?yàn)椋?4℃ 30 s，72℃ 3 min，5個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 3 min，5 個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 30 s，25 個(gè)循環(huán)。 產(chǎn)物于 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 序列測(cè)序拼接及RT-PCR驗(yàn)證和酶切驗(yàn)證

將反轉(zhuǎn)錄PCR的產(chǎn)物、3′RACE的產(chǎn)物及5′RACE第二輪的產(chǎn)物分別連接到T載體上進(jìn)行測(cè)序。利用DNAMAN軟件將3′端和5′端的保守區(qū)段進(jìn)行重疊序列拼接，并根據(jù)此序列設(shè)計(jì)引物 （BvMARB－4、BvMARB－5，表1）擴(kuò)增全長(zhǎng)的cDNA序列。對(duì)PCR驗(yàn)證后的陽(yáng)性克隆用SacI進(jìn)行酶切鑒定。

表1 BvMARB擴(kuò)增引物Table 1 PCR primers of BvMARB gene

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜BvMARB全長(zhǎng)cDNA序列擴(kuò)增

通過(guò)對(duì)甜菜花蕾的總RNA反轉(zhuǎn)錄的PCR擴(kuò)增，獲得了582 bp的特異條帶（圖1）。通過(guò)序列同源比較發(fā)現(xiàn)，其與煙草（GenBank No.AB059832）、番茄（GenBank No.BT013761）和擬南芥（GenBank No.AY096684）的相應(yīng)保守片段相似率分別為84.02%、81.96%和81.27%，初步證實(shí)了獲得的特異條帶為目的基因BvMARB的基因片段。

為了獲得全長(zhǎng)cDNA序列，實(shí)驗(yàn)繼續(xù)采用了3′RACE和5′RACE擴(kuò)增。如圖2a所示，通過(guò)3′RACE PCR，獲得了1.6 kb大小的產(chǎn)物片段；同時(shí)，5′RACE擴(kuò)增的結(jié)果顯示，第一輪擴(kuò)增并沒(méi)有獲得明顯條帶；繼而取第一輪5′RACE產(chǎn)物稀釋10倍后作巢式PCR的模板，擴(kuò)增BvMARB基因的5′末端，電泳結(jié)果出現(xiàn)大約667 bp 的條帶（圖 2b）。

圖1 甜菜BvMARB基因核心片段的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR of sugar beet BvMARB's core sequence

圖2 甜菜BvMARB基因3′RACE和5′RACE擴(kuò)增Fig.2 3′RACE and 5′RACE of sugar beet BvMARB

圖3 甜菜BvMARB全長(zhǎng)序列鑒定Fig.3 Identification of BvMARB's full length sequence

2.2 甜菜BvMARB基因的克隆

將已測(cè)序的BvMARB cDNA保守片段3′末端和5′末端片段相互重疊，從而拼接出全長(zhǎng)cDNA序列。為了進(jìn)一步確定所獲得基因的正確性，實(shí)驗(yàn)分別對(duì)甜菜BvMARB全長(zhǎng)基因進(jìn)行了PCR和酶切檢測(cè)。PCR擴(kuò)增后在1 800 bp左右的位置獲得了目的條帶（圖3a）；而由于BvMARB全序列上有兩個(gè)SacI單酶切位點(diǎn)，因而經(jīng)酶切鑒定后應(yīng)得到一個(gè)1 000 bp和兩個(gè)400 bp左右的片段（圖3b）。

2.3 甜菜BvMARB全長(zhǎng)cDNA序列分析

甜菜BvMARB基因全長(zhǎng)序列為2 023 bp，含有690個(gè)腺嘌呤（34.1%）、313個(gè)胞嘧啶（15.5%）、499個(gè)鳥嘌呤（24.7%）和 521 個(gè)胸腺嘧啶（25.8%）。采用 NCBI的 Blast（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）對(duì)核酸序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，BvMARB基因與煙草MARB（GenBank No.AB059832）的相似度為67.20%，與番茄MARB（GenBank No.BT013761）的相似度為61.26%，與擬南芥MARB（GenBank No.AY096684）的相似度為57.19%。 運(yùn)用 NCBI中的 ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）和 EXPASY（http://au.expasy.org/tools/）對(duì)該基因的核苷酸序列進(jìn)行ORF查找及氨基酸序列推導(dǎo)分析，發(fā)現(xiàn)甜菜BvMARB基因中含有一個(gè)長(zhǎng)度為1 719 bp，編碼572個(gè)氨基酸殘基的完整的開放閱讀框，始于50 bp，止于1 768 bp，含有49 bp的5′非編碼序列，227 bp的3′非編碼序列以及31 bp的poly (A)Tail。該蛋白預(yù)期的分子量為63.17 kDa，pI=9.2。通過(guò)PSORT（prediction of protein localization sites，version 6.4）分析表明，基因所編碼的蛋白主要存在于細(xì)胞核中。

3 討論

甜菜是我國(guó)重要的糖料作物，甜菜的M14單體附加系是具有無(wú)融合生殖特點(diǎn)的材料，是黑龍江大學(xué)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的研究成果。近年來(lái)，重要目的基因的克隆已成為農(nóng)作物分子育種領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。眾多研究結(jié)果表明植物的生殖是由多基因控制的，屬于數(shù)量性狀遺傳特性，同時(shí)單基因的表達(dá)豐度較低，這就給利用差異顯示等方法進(jìn)行基因克隆帶來(lái)了難度。甜菜BvMARB是一類具有代表性的生殖相關(guān)蛋白。本研究中利用在其它物種中已有的生殖相關(guān)基因的保守序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，結(jié)合采用3′RACE、5′RACE技術(shù)對(duì)BvMARB的全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行了克隆。研究中通過(guò)對(duì)擴(kuò)增條件的反復(fù)實(shí)驗(yàn)，在擴(kuò)增5′非翻譯領(lǐng)域的序列時(shí)，優(yōu)化了巢式PCR的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，內(nèi)側(cè)引物和外側(cè)引物進(jìn)行了交叉使用，采用多輪次的PCR擴(kuò)增，內(nèi)側(cè)引物擴(kuò)增后又使用了外側(cè)引物的擴(kuò)增片段，降低了產(chǎn)物的非特異性，反應(yīng)的敏感性得到了大幅度提升。

改良后的RACE擴(kuò)增體系對(duì)未知基因3′端5′端非翻譯領(lǐng)域片段的擴(kuò)增效率大幅提高，出現(xiàn)非特異條帶幾率也大幅下降。不同物種間的遺傳背景差距，使得某一基因在不同物種中的同源性差異很大。另外，基因的表達(dá)也存在時(shí)空差異性，在某一物種中強(qiáng)烈表達(dá)的基因在其他物種中突變?yōu)槌聊?。基因表達(dá)的豐度也存在很大差異，在整個(gè)開花期和花蕾中具體表達(dá)部位也具有不確定性，這便加大了克隆的難度。基因組內(nèi)的結(jié)構(gòu)看家基因表達(dá)豐富，使得克隆出的片段經(jīng)測(cè)序后為一些結(jié)構(gòu)基因的非特異片段，而非目的基因片段，如rRNA基因，表達(dá)量基因的克隆比較困難。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)中優(yōu)化的相關(guān)參數(shù)，提高了cDNA模板的質(zhì)量以及用量，優(yōu)化PCR擴(kuò)增體系中的多個(gè)技術(shù)參數(shù)，最后獲得了BvMARB的全長(zhǎng)cDNA序列并進(jìn)行了初步分析，為后續(xù)BvMARB基因的功能研究以及基因的應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。