不同產(chǎn)地黃精多糖含量測定及其體外抗氧化活性研究

何曉梅，李 超，李永忠，李語涵，陳存武

(1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012；2.植物細(xì)胞工程安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 六安 237012)

黃精(PolygonatumsibiricumRed.)、多花黃精(PolygonatumcyrtonemaHua )與滇黃精(PolygonatumkingianumColl.et Hemsl.)屬百合科黃精屬多年生草本植物，是中藥材黃精的基原植物，被《中國藥典》(2015年版一部)收錄的我國傳統(tǒng)的中藥資源，具有藥食同源性[1](P307)。研究表明，黃精具有滋潤心肺、補(bǔ)中益氣、強(qiáng)壯筋骨、延年益壽等作用[2]。黃精成分豐富[3]，而其最主要且研究最多的生物活性物質(zhì)為黃精多糖，具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)血糖血脂、調(diào)節(jié)免疫力、抗氧化、抑菌、抗動脈粥樣硬化及保護(hù)心腦血管等重要功能[4-5]。本研究采用熱水浸提法提取黃精多糖，乙醇沉淀得到黃精粗多糖，以不同濃度黃精多糖對DPPH自由基和羥基自由基的清除作用研究其體外抗氧化活性，旨在對黃精的種植及黃精產(chǎn)品的開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

材料：湖北、湖南、金寨、青陽和河南(黃精品種)5個產(chǎn)地同年份黃精藥材，前4個產(chǎn)地品種為多花黃精。藥材經(jīng)皖西學(xué)院陳存武教授鑒別為百合科植物黃精屬的干燥根莖。經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過篩，置于電熱干燥器中干燥，備用。

試劑：無水乙醇、蒽酮、濃硫酸、葡萄糖、水楊酸、硫酸亞鐵、30%過氧化氫、DPPH·(1，1-二苯基-2-苦基肼)等試劑，均為國產(chǎn)分析純。實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水。

1.2 主要儀器設(shè)備

粉碎機(jī)(1000克密封型搖擺式粉碎機(jī))、ZMD-2型電子分析天平(上海方瑞儀器有限公司)、恒溫水浴箱(常州普天儀器制造有限公司)、SY-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)、TU1901型紫外分光光度計(上海元析儀器有限公司)，SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器廠)、電熱干燥箱(智能型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取經(jīng)105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖對照品1.000 g，置于1000 mL容量瓶中溶解并稀釋到刻度，搖勻，即得濃度為1 mg/mL的葡萄糖貯備液。分別取濃度為1 mg/mL的葡萄糖溶液1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL于6只100 mL容量瓶中，加水定容到刻度，得到濃度為0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.10 mg/mL的葡萄糖對照品溶液。依次量取上述對照品溶液1 mL于6只干燥潔凈的試管中，在冰水浴中緩慢滴加0.2%(g/mL)蒽酮-硫酸溶液4 mL，混勻置于沸水浴中反應(yīng)10 min，取出，立即置冰水浴中冷卻10 min，取出，以雙蒸水為空白對照，根據(jù)紫外可見分光光度法測定原理，進(jìn)行光譜圖掃描，找出最大吸收波長，并讀出該波長處不同濃度對照品溶液的吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得y=9.5707x-0.0102，R2=0.996，如圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.2 黃精多糖的制備

分別取60 ℃干燥至恒重的60目的黃精干粉10 g加入300 mL 80%乙醇置于水浴中回流脫脂脫色，直至濾紙上無油跡和色斑，揮干粉末。然后將上述處理的黃精粉末各加入300 mL蒸餾水，在80 ℃浸提三次，每次2 h，合并提取液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空減壓濃縮到300 mL。按體積比1∶4加入無水乙醇，邊加入邊攪拌，4 ℃醇沉12 h，5000 rpm離心20 min得黃精多糖，依次用乙醚、丙酮和無水乙醇洗滌、離心，干燥，備用[6]。

1.3.3 黃精多糖含量測定及提取率的計算

根據(jù)1.3.2的方法，取1 mL提取液，同葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法測定吸光度值，計算多糖提取率。

黃精多糖濃度(mg/mL)=(A584-0.0102)/9.5707

黃精多糖質(zhì)量(g)=黃精多糖濃度*稀釋倍數(shù)*黃精多糖溶液總體積*1000

黃精多糖提取率(%)=黃精多糖質(zhì)量/黃精粉末質(zhì)量

1.3.4 DPPH清除率測定

DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，其醇溶液呈現(xiàn)深紫色，在517 nm波長處有強(qiáng)吸收，加入抗氧化劑后，517 nm波長處的吸光度減弱。將不同產(chǎn)地黃精多糖配成不同濃度的溶液，吸取2 mL樣品于試管中，再加入0.02 mol/L DPPH溶液(無水乙醇配制)充分搖勻，在室溫下避光保存30 min，然后在517 nm波長處測定吸光度，并以VC作陽性對照，按下列公式計算各試樣對DPPH自由基清除率[7]。

清除率/%=[A2-(A1-A3)]/A2*100%

式中：A1：2 mL多糖溶液+2 mL DPPH的吸光度

A2:2 mL水+2 mL DPPH的吸光度

A3：2 mL多糖溶液+2 mL無水乙醇的吸光度

調(diào)零：2 mL水+2 mL無水乙醇

1.3.5 對羥基自由基清除能力的測定

各取7支試管，第1～5管加入1 mL不同濃度多糖樣液，0.5 mL 9 mmol/L FeSO4溶液，0.5 mL 9 mmol/L水楊酸溶液，2.5 mL蒸餾水，最后加入0.5 mL 9 mmol/L H2O2溶液啟動反應(yīng)。第6管加入1 mL不同濃度多糖樣液，0.5 mL 9 mmol/L FeSO4溶液，0.5 mL 9 mmol/L水楊酸溶液，2.5 mL蒸餾水，0.5 mL蒸餾水。第7管加入1 mL蒸餾水，0.5 mL 9 mmol/L FeSO4溶液，0.5 mL 9 mmol/L水楊酸溶液，2.5 mL蒸餾水，0.5 mL 9 mmol/L H2O2溶液。

在37 ℃條件下反應(yīng)30 min，在510 nm波長處檢測吸光度[8]。按照如下公式，計算清除率：

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100

式中A1為加入不同濃度多糖溶液時的吸光度值，A2為蒸餾水代替H2O2溶液時的吸光度，A3為蒸餾水代替多糖溶液時的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地黃精可溶性多糖得率

表1 不同產(chǎn)地黃精粗多糖提取率

表2 不同產(chǎn)地黃精可溶性多糖得率

從表1可知，湖南的黃精粗多糖提取率最高，為11.93%；其次是河南9.42%，金寨8.71%，青陽8.04%，湖北為6.27%。經(jīng)過紫外分光光度法測定，由表2可知，金寨的可溶性多糖得率最高，為6.360%，其次分別為湖南5.847%、青陽4.181%、河南2.732%、湖北1.405%。由此可見，通過1.3.2方法制備的醇沉黃精粗多糖，溶解后，通過蒽酮-硫酸比色法測定其可溶性多糖含量表明，每種黃精含有的可溶性多糖得率不同，金寨產(chǎn)黃精可溶性多糖含量最高。

2.2 不同產(chǎn)地黃精多糖對DPPH清除率的測定

由圖2可知，不同產(chǎn)地黃精粗多糖對DPPH清除率與其濃度呈一定的劑量關(guān)系，且隨多糖濃度的增加，清除率逐漸增大。在實(shí)驗(yàn)研究的濃度范圍內(nèi)，湖北黃精多糖對DPPH清除率最優(yōu)，最大達(dá)到98.76%。其次是河南黃精多糖，最大清除率達(dá)到91.36%；金寨、湖南和青陽黃精多糖對DPPH清除率依次69.73%、68.74%和56.86%。湖北黃精多糖和河南黃精多糖對DPPH清除率明顯優(yōu)于其他三種。

圖2 多糖濃度與DPPH清除率的相關(guān)性

2.3 不同產(chǎn)地黃精多糖對羥基自由基清除能力的測定

圖3 多糖濃度與羥基自由基清除率的相關(guān)性

由圖3可知，在實(shí)驗(yàn)研究的濃度范圍內(nèi)，不同產(chǎn)地黃精粗多糖對羥基自由基清除率隨濃度的增加而增大。湖南產(chǎn)地黃精多糖對羥基自由基清除率效果最優(yōu)，最高達(dá)到97.43%。湖北與河南產(chǎn)地黃精多糖對羥基自由基清除率較為接近，依次為83.98%和82.57%。金寨黃精多糖對羥基自由基清除率最高達(dá)到75.83%。青陽黃精多糖對羥基自由基清除率最差。

3 結(jié)論

湖南黃精、河南黃精、金寨黃精、青陽黃精、湖北黃精粗多糖得率依次為11.932%、9.421%、8.712%、8.040%、6.269%；金寨黃精、湖南黃精、青陽黃精、河南黃精、湖北黃精可溶性多糖得率依次為6.360%、5.847%、4.181%、2.732%、1.405%；醇沉粗多糖得率和水溶性多糖得率不成對應(yīng)關(guān)系，可能與不同黃精多糖的成分和結(jié)構(gòu)有關(guān)。

湖南黃精、河南黃精、金寨黃精、青陽黃精、湖北黃精粗多糖對DPPH自由基和羥基自由基均有不同程度的清除作用，且呈一定的劑量關(guān)系。在試驗(yàn)研究的濃度范圍內(nèi)，湖北黃精粗多糖對DPPH自由基的清除作用最強(qiáng)；湖南黃精粗多糖對羥基自由基清除能力最強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明5個產(chǎn)地黃精粗多糖對DPPH自由基和羥基自由基清除能力不具有一致性，有待進(jìn)一步研究。