松乳菇子實體人工誘導(dǎo)方法研究

詹少華

(皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012)

松乳菇lactariusdelicious屬于紅菇科、乳菇屬，安徽本地俗稱該食用菌為雁來菇或松菇，目前市場上的松乳菇都是采集于野外，松乳菇味道鮮美獨特，市場上價格較高，鮮菇每公斤100元左右，松乳菇季節(jié)性較強，安徽省主要在每年的初秋上市。松乳菇營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)的含量在20%以上，粗脂肪和糖類的含量品種間差異較大，脂類和總糖含量分別可達(dá)20%和15%，各類微量元素較為豐富，尤其是鈣、鐵、鋅、銅、錳含量較高。松乳菇的谷氨酸、天冬氨酸含量較高，這與松乳菇的獨特鮮味有關(guān)[1-2]。松乳菇具有很強的保健功效，松乳菇多糖具有抗腫瘤和抗炎作用[3-4]，松乳菇含有愈創(chuàng)木烷倍半萜類化合物，能夠清除細(xì)胞毒素和抗菌活性[5]。

松乳菇人工栽培具有較大的經(jīng)濟價值，但是松乳菇完全人工栽培目前中外尚未見可信的報道。松乳菇的母種和原種制備并不困難，常見的PDA培養(yǎng)基就可以培養(yǎng)松乳菇母種和原種，麥芽糖、葡萄糖和淀粉作碳源松乳菇的菌絲都可以很好的生長[6]，維生素B1、赤霉素、三十烷醇和肌醇等物質(zhì)可以促進松乳菇菌絲的生長[7]。半固體培養(yǎng)基松乳菇菌絲生長速度較快，可以得到棕黃色的菌絲，且可以觀察到類似子實體原基的菌絲團[8]。松乳菇在馬尾松林下半人工栽培效果并不理想，出菇數(shù)量很少[9]，松乳菇人工栽培困難較大，這與松乳菇屬于馬尾松等植物外生菌根類真菌有關(guān)[10]，人工栽培條件下，菌絲不能從松樹上獲得某類活性物質(zhì)[11]。

松乳菇人工栽培是一個誘人的課題，這不僅僅是松乳菇營養(yǎng)價值高，經(jīng)濟效益前景可觀，更重要的是為其他外生菌根菌的人工馴化提供可行性的方法，同時對研究外生菌根菌的子實體形成機理提供理論依據(jù)。近年來，本實驗室利用固體發(fā)酵原理，在培養(yǎng)基的成分、培養(yǎng)條件，尤其在培養(yǎng)方式方面不斷嘗試，成功誘導(dǎo)出松乳菇的子實體，報道如下。

1 試驗材料與方法

1.1 菌絲擴繁培養(yǎng)基配方

菌絲擴繁培養(yǎng)基配方1：蔗糖5 g、淀粉15 g、蛋白胨2 g、磷酸二氫鉀0.02 g、硫酸鎂0.01 g、氯化鈉0.5 g 、VB10.001 g、瓊脂9 g，總體積1000 ml，配制方法見參考文獻[4]。

菌絲擴繁培養(yǎng)基配方2：各營養(yǎng)成分同配方1，雜樹葉代替瓊脂，雜樹葉剪成不超過1 cm×1 cm大小，雜樹葉清水中浸泡2 h，瀝干1 h，然后依次拌入各營養(yǎng)成分，雜樹葉總體積1000 ml。雜樹葉來源于皖西學(xué)院校園內(nèi)各類闊葉類樹葉。

菌絲擴繁培養(yǎng)基配方3：各營養(yǎng)成分同配方1，小樹枝代替瓊脂，小樹枝剪成0.5 cm×0.5 cm ×0.5 cm大小，小樹枝清水中浸泡2 h，瀝干1 h，然后依次拌入各營養(yǎng)成分，小樹枝總體積1000 ml。小樹枝來源于皖西學(xué)院校園內(nèi)各類闊葉類植物。

1.2 子實體誘導(dǎo)培養(yǎng)基

子實體誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方1(g/g)：托盤為20 cm×20 cm×20 cm塑料框，雜樹葉70%、棉籽殼20%、玉米粉3%、豆粕5%、蔗糖1.5%、碳酸鈣0.5%，自然pH。配制方法：雜樹葉清水中浸泡2 h，瀝干1 h，依次加入上述成分，混勻，培養(yǎng)基填滿整個托盤。

子實體誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方2：托盤為20 cm×20 cm×20 cm塑料框，雜樹葉用水充分浸泡2 h，然后瀝干1 h，托盤中鋪墊5 cm厚的雜樹葉→加入上述配方1培養(yǎng)基10 cm→雜樹葉填滿托盤；

子實體誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方3：托盤中間部分填充10 cm×10 cm×20 cm配方1培養(yǎng)基，其余部分填充雜樹葉；

子實體誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方配方4：托盤中間部分填充10 cm×10 cm×20 cm雜樹葉，，其余部分填充配方1培養(yǎng)基。

1.3 子實體誘導(dǎo)培養(yǎng)條件及方法

栽培種的接種量按照培養(yǎng)基總量的1/10(v/v)，子實體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的雜樹葉不接種菌種，栽培種接種后，28 ℃、濕度70%避光培養(yǎng)30 d，再17 ℃、濕度80%散射光繼續(xù)培養(yǎng)10 d，觀察子實體誘導(dǎo)效果。

1.4 補料培養(yǎng)方法

子實體誘導(dǎo)成功后，在培養(yǎng)基上方滴加營養(yǎng)液10 ml，濕度60%、17 ℃培養(yǎng)2 d，然后再濕度85%、17 ℃培養(yǎng)10 d，觀察子實體發(fā)育狀況。

表1 補料營養(yǎng)液配方(1000 ml)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌絲擴繁培養(yǎng)基的子實體誘導(dǎo)效果

表2是三種不同的菌絲擴繁培養(yǎng)基，分別接種到子實體誘導(dǎo)培養(yǎng)基選用配方3中，因為直徑數(shù)毫米的子實體太多，難以準(zhǔn)確計數(shù)，且目測的方法也難以與一般的菌絲團相鑒別，所以只將子實體高度達(dá)到1 cm以上的用于計數(shù)和分析。子實體有呈現(xiàn)單個生長，也有簇生呈菊花狀生長(圖2)，顏色具有純白色、淡黃色或棕色。利用菌絲擴繁培養(yǎng)基配方1進行接種，沒有發(fā)現(xiàn)菊花狀的子實體，菌絲擴繁培養(yǎng)基配方2和配方3的子實體數(shù)量較多，但是多個子實體簇生呈菊花狀，這種菊花狀的子實體存活2天后逐漸枯萎?？傮w來看，菌絲擴繁培養(yǎng)基配方1是三種培養(yǎng)基中最理想的培養(yǎng)基。

表2 不同菌絲擴繁培養(yǎng)基的子實體誘導(dǎo)效果

圖1 子實體誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方3中生長的子實體

圖2 子實體簇生呈菊花狀

2.2 三種子實體誘導(dǎo)培養(yǎng)基對松乳菇生長的影響

菌絲擴繁培養(yǎng)基選用配方1，分別接種到三種不同的子實體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，子實體高度達(dá)到1 cm以上的用于計數(shù)和分析。從子實體數(shù)量來看，如圖3所示，子實體誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方4生長的子實體最多，但是菌蓋較小，菌柄較長，這種子實體繼續(xù)培養(yǎng)，存活2天后枯萎。子實體誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方2和配方3培養(yǎng)的松乳菇，菌蓋較大，菌柄較短，繼續(xù)培養(yǎng)可以5天以上，子實體誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方1生長的子實體，子實體數(shù)量少且細(xì)長，總體來看子實體誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方3是最理想的培養(yǎng)基。

表3 三種子實體誘導(dǎo)培養(yǎng)基對松乳菇子實體誘導(dǎo)效果的影響

2.3 補料營養(yǎng)液對松乳菇子實體發(fā)育的影響

菌絲擴繁培養(yǎng)基選用配方1，子實體誘導(dǎo)培養(yǎng)基選用配方3，5種補料營養(yǎng)液的區(qū)別在于蛋白胨含量的區(qū)別，也就是碳氮比的不同。表4表明，各種補料營養(yǎng)液都可以提高子實體的成活率，補料營養(yǎng)液配方4對原有子實體的生長作用最理想，主要表現(xiàn)為無衰退子實體比例最高，同時菌柄較短，菌蓋較大，子實體的顏色接近野生松乳菇的顏色。補料培養(yǎng)過程中，補料營養(yǎng)液配方3更有利于新子實體的產(chǎn)生。

圖3 子實體誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方4生長的子實體

對照配方1配方2配方3配方4配方5原有子實體無衰退的比例/%2.76.317.223.535.631.3顏色淡黃色淡黃色淡黃色棕黃色棕黃色棕黃色菌柄長度/cm3.73.63.12.82.61.9菌蓋直徑/cm1.21.31.71.92.32.1新生子實體數(shù)量/個813271276756顏色淡黃色淡黃色淡黃色棕黃色棕黃色棕黃色菌柄長度/cm3.73.62.80.91.71.9菌蓋直徑/cm0.40.40.50.80.50.7

圖4 補料培養(yǎng)得到的松乳菇子實體

3 討論

本試驗表明松乳菇在完全脫離松樹環(huán)境下，在實驗室里可以誘導(dǎo)出松乳菇的子實體，這說明松乳菇人工栽培完全可行，以前未發(fā)現(xiàn)這方面可信的報道，方平夷采用棉籽殼培養(yǎng)基[12]，室內(nèi)自然條件下培養(yǎng)，該文獻報道說觀察到了松乳菇的子實體，從該文的子實體誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方來看，棉籽殼90%，腐爛茅草8%，蔗糖2%，該培養(yǎng)基無水分，本實驗室重復(fù)該實驗，發(fā)現(xiàn)該培養(yǎng)基連松乳菇的菌絲都不能生長，該實驗沒有對松乳菇培養(yǎng)的濕度進行控制，任何食用菌都難以形成子實體。

菌絲擴繁培養(yǎng)基是一種半固體培養(yǎng)基，半固體培養(yǎng)基作為菌絲擴繁培養(yǎng)基是誘導(dǎo)松乳菇子實體的關(guān)鍵因素之一，而其他培養(yǎng)基培養(yǎng)松乳菇菌絲時，往往產(chǎn)生較多的菌絲分泌物，這些分泌物又抑制了菌絲進一步的生長和分化。

子實體誘導(dǎo)培養(yǎng)基的設(shè)計依據(jù)來源于我們對野生松乳菇生長環(huán)境的觀察，在野生條件下，松乳菇生長在雜樹葉的腐質(zhì)土環(huán)境中，松乳菇可以利用雜樹葉作為碳源，所以子實體誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以雜樹葉為主要原料，同時在子實體培養(yǎng)基添加豆粕等原料補充氮源。雜樹葉在子實體誘導(dǎo)方面起到了重要作用，子實體誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方3是最理想的培養(yǎng)基，這與該培養(yǎng)基中四周具有雜樹葉覆蓋有關(guān)，松乳菇菌絲生長具有攀爬支持物的特點，這樣菌絲可以生長更長，產(chǎn)生更多的分支，雜樹葉之間的空隙菌絲生長密集，有利于菌絲之間扭結(jié)到一起產(chǎn)生子實體原基，松乳菇的原基多數(shù)生長在雜樹葉上，尤其是在葉脈處松乳菇的原基較多，雜樹葉還有保濕作用，提供菌絲生長和產(chǎn)生原基的微環(huán)境。

補料培養(yǎng)有利于子實體的繼續(xù)發(fā)育，這可能是因為補料培養(yǎng)提供了新的營養(yǎng)液，但是我們觀察發(fā)現(xiàn)，子實體形成時，培養(yǎng)基中的豆粕等物質(zhì)還大量存在，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)還有很多沒有被消耗，補充新的營養(yǎng)液，促進子實體的生長，還可能因為補料營養(yǎng)液改變了培養(yǎng)基的酸堿度等因素。本試驗補料培養(yǎng)研究表明，松乳菇的子實體形成和子實體進一步發(fā)育可能需要不同的培養(yǎng)基，這是在其他食用菌栽培過程中沒有發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象。

本試驗得到的松乳菇子實體菌蓋最大直徑約4 cm，而野生的松乳菇菌蓋直徑可達(dá)到10 cm以上，這說明松乳菇人工栽培尚需進一步探索，下一步研究的重點是松乳菇子實體不同發(fā)育階段的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。