雌二醇對(duì)前列腺上皮細(xì)胞增殖的影響及相關(guān)機(jī)制

楊宇峰 莊 炫 邢金春 (廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，福建 廈門 361003)

前列腺增生(BPH)與男性的年齡及睪丸功能密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)60歲及以上有超過(guò)50%患有此病〔1，2〕。目前BPH的發(fā)病機(jī)制尚未明確，前列腺細(xì)胞數(shù)目增多及間質(zhì)成分的增加是BPH的主要病理特征，因此細(xì)胞的增殖與凋亡成為BPH發(fā)病機(jī)制的熱點(diǎn)研究方向之一。另外中老年人睪丸功能減弱，雄激素分泌較少，而雌激素分泌量增加，因此雌激素被認(rèn)為是BPH發(fā)生的主要致病因素〔3〕，且BPH發(fā)病過(guò)程中一定濃度的雌激素能與雌激素受體結(jié)合，進(jìn)而刺激前列腺上皮細(xì)胞增殖，導(dǎo)致BPH的發(fā)生〔4〕，但具體的作用機(jī)制未知，本研究擬探討雌二醇對(duì)前列腺上皮細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 雌二醇購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)有限公司;EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司;兔抗人B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2、Bal-2相關(guān)X蛋白(Bax)、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、CyclinE、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、p-AKT及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。MK3酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)thermo公司;FACSCalibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司;TS100倒置熒光顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司。

1.2 MTT法檢測(cè)BPH-1前列腺上皮細(xì)胞活力 將6×103個(gè)BPH-1前列腺上皮細(xì)胞接種到96孔板，培養(yǎng)24 h后，0(對(duì)照組)、10－9、10－8、10－7、10－6、10－5mmol/L的雌二醇作用BPH-1細(xì)胞48 h，每孔加入終濃度為5 mg/ml的MTT并孵育4 h后，舍棄上清液，再加入150 μl二甲基亞砜，震蕩使結(jié)晶物溶解，于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)560 nm處測(cè)OD值。

1.3 EdU染色檢測(cè)BPH-1前列腺上皮細(xì)胞增殖情況將6×103個(gè)BPH-1細(xì)胞接種到96孔板，培養(yǎng)24 h后，0、10－8、10－7、10－6mmol/L 雌二醇作用 BPH-1 細(xì)胞48 h，根據(jù)EdU試劑盒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定，染色，最后于熒光顯微鏡下觀察并拍照。EdU染色呈現(xiàn)紅光，Hoechst染色呈現(xiàn)藍(lán)光。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BPH-1前列腺上皮細(xì)胞周期將 9×103個(gè) BPH-1 細(xì)胞接種到 6 孔板，0、10－8、10－7、10－6mmol/L雌二醇作用BPH-1細(xì)胞48 h，每組收集1×105/ml個(gè)細(xì)胞，再加入Rnase并吹打混勻后，37℃孵育1 h，繼續(xù)加入碘化丙啶(PI)染液，吹打混勻并于室溫避光孵育30 min，1 h內(nèi)在流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)分析。

1.5 Western印跡檢測(cè)BPH-1前列腺上皮細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 將9×103個(gè)BPH-1 細(xì)胞接種到 6 孔板，0、10－8、10－7、10－6mmol/L雌二醇作用BPH-1細(xì)胞48 h，在4℃條件下刮下細(xì)胞并裂解30 min，離心收集上清液即是總蛋白。采用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。制作濃縮膠及分離膠，并水封室溫靜置30 min。蛋白樣品煮沸后上樣，進(jìn)行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳1～2 h。5%脫脂奶粉封閉 1 h，一抗溶液(兔抗人 Bax、Bcl-2、CyclinD1、CyclinE、PI3K、p-AKT、AKT 及 GAPDH 多克隆抗體，稀釋度為1∶100)孵育，4℃過(guò)夜;二抗溶液室溫孵育1～2 h。于凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 雌二醇對(duì)BPH-1前列腺上皮細(xì)胞活力的影響與對(duì)照組(0.48±0.04)比較，10－8(0.55±0.05)、10－7(0.63±0.06)、10－6mmol/L 雌二醇(0.75±0.07)能顯著提高細(xì)胞活力(P＜0.05)，而 10－9mmol/L雌二醇(0.49±0.04)對(duì)細(xì)胞活力無(wú)影響(P＞0.05)，10－5mmol/L雌二醇(0.42±0.04)顯著降低細(xì)胞活力(P＜0.05)。

2.2 雌二醇對(duì)BPH-1前列腺上皮細(xì)胞增殖能力的影響 10－8、10－7、10－6mmol/L 雌二醇作用 BPH-1 細(xì)胞48 h 后，經(jīng) EdU 染色發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，10－8、10－7、10－6mmol/L雌二醇能顯著提高細(xì)胞增殖率(P＜0.05)。見(jiàn)圖1，表1。

2.3 雌二醇對(duì)BPH-1前列腺上皮細(xì)胞周期的影響與對(duì)照組比較，10－8、10－7、10－6mmol/L 雌二醇縮短細(xì)胞的G1期，使細(xì)胞快速進(jìn)入細(xì)胞分裂(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

2.4 雌二醇對(duì) BPH-1細(xì)胞中 Bax、Bcl-2、CyclinD1及CyclinE 含量的影響 與對(duì)照組比較，10－8、10－7、10－6mmol/L雌二醇能顯著下調(diào) Bax表達(dá)，顯著上調(diào)Bcl-2、CyclinD1及 CyclinE 表達(dá)(P＜0.05)。見(jiàn)表 1，圖2。

圖1 雌二醇對(duì)BPH-1前列腺上皮細(xì)胞增殖能力的影響(×200)

表1 雌二醇對(duì)BPH-1細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期、BPH-1細(xì)胞中Bax，Bcl-2，CyclinD1及CyclinE含量的影響(，%，n=6)

表1 雌二醇對(duì)BPH-1細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期、BPH-1細(xì)胞中Bax，Bcl-2，CyclinD1及CyclinE含量的影響(，%，n=6)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.01;下表同

組別 細(xì)胞周期增殖率 G1期 S期 G2期Bax/GAPDH Bcl-2/GAPDH CyclinD1/GAPDH CyclinE/GAPDH對(duì)照組 0 68.42±6.84 13.58±1.35 18.00±1.80 0.98±0.10 0.15±0.01 0.20±0.02 0.21±0.02 10－8mmol/L 組 18.34±1.821) 59.32±5.921) 16.47±1.651) 24.21±2.421) 0.49±0.051) 0.19±50.021) 0.33±0.031) 0.34±0.031)10－7mmol/L 組 27.21±2.721) 53.46±5.351) 19.48±1.951) 27.06±2.701) 0.25±0.021) 0.32±0.031) 0.65±0.061) 0.66±0.071)10－6mmol/L 組 38.42±3.841) 48.33±4.831) 22.35±2.231) 29.32±2.931) 0.18±0.021) 0.95±0.091) 0.99±0.101) 1.02±0.101)

圖2 雌二醇對(duì)BPH-1細(xì)胞中Bax、Bcl-2、CyclinD1及CyclinE含量的影響

2.5 雌二醇對(duì)BPH-1細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，10－8、10－7、10－6mmol/L雌二醇能顯著上調(diào)PI3K及p-AKT表達(dá)(P＜0.05)。見(jiàn)表 2，圖 3。

表2 雌二醇對(duì)BPH-1細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(，n=6)

表2 雌二醇對(duì)BPH-1細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(，n=6)

組別 PI3K/GAPDH p-AKT/AKT對(duì)照組 0.13±0.01 0.10±0.01 10－8mmol/L 組 0.25±0.021) 0.20±0.021)10－7mmol/L 組 0.42±0.041) 0.38±0.031)10－6mmol/L 組 1.33±0.131) 1.06±0.101)

圖3 雌二醇對(duì)BPH-1細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

目前研究認(rèn)為男性體內(nèi)雄-雌激素失衡是BPH發(fā)生的重要原因，其中雌激素以具有活性的雌二醇形式存在，雌二醇在BPH過(guò)程中分泌量增加〔3〕。雌二醇能與存在于前列腺間質(zhì)細(xì)胞中的受體結(jié)合，進(jìn)而激活下游信號(hào)通路，刺激前列腺上皮細(xì)胞增殖，但具體的作用機(jī)制未知。本研究結(jié)果與雌二醇對(duì)成骨細(xì)胞及子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖促進(jìn)作用的劑量濃度范圍一致〔5〕，也與以往學(xué)者報(bào)道一致〔4〕，說(shuō)明一定濃度范圍的雌二醇對(duì)BPH-1細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，超過(guò)一定濃度后對(duì)BPH-1細(xì)胞增殖具有抑制作用。

BPH與前列腺細(xì)胞過(guò)度增殖密切相關(guān)，此過(guò)程與細(xì)胞周期有關(guān)。細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的缺陷及重大轉(zhuǎn)變都有可能使細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)生異?！?〕，大部分成熟的前列腺細(xì)胞基本處于G1期即休眠期，當(dāng)受到上游信號(hào)刺激后，G1期的中、后期發(fā)生重大轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入S期，加快DNA的合成〔6〕。與G1期密切相關(guān)的細(xì)胞周期蛋白有CyclinD1與CyclinE。CyclinD1先在G1期表達(dá)，與細(xì)胞周期依賴性蛋白(CDK)4/CDK6結(jié)合形成復(fù)合物，促使Rb磷酸化及核轉(zhuǎn)錄因子E2F進(jìn)入細(xì)胞核，推動(dòng)與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。在CyclinD1降解后，CyclinE是G1期起主要促進(jìn)作用的細(xì)胞周期蛋白，與CDK2結(jié)合形成復(fù)合物，促使G1期向S期轉(zhuǎn)換，并延續(xù)DNA的復(fù)制。另外細(xì)胞的過(guò)度增殖來(lái)源于細(xì)胞凋亡的抑制，細(xì)胞凋亡受細(xì)胞凋亡基因調(diào)控，其中Bcl-2是最常見(jiàn)的細(xì)胞凋亡家族。Bcl-2能與促凋亡蛋白Bax形成異源二聚體，阻斷凋亡信號(hào)傳遞，促進(jìn)細(xì)胞存活及增殖。而B(niǎo)ax能自身形成二聚體，促進(jìn)凋亡信號(hào)傳遞到Caspase家族，并放大凋亡信號(hào)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果說(shuō)明一定濃度范圍內(nèi)的雌二醇能夠通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)BPH-1細(xì)胞的增殖。

細(xì)胞的增殖、凋亡與多種信號(hào)通路密切相關(guān)，PI3K/AKT信號(hào)通路是其中最為常見(jiàn)的一種。PI3K是由p110和p85亞單位組成的二聚體，能夠?qū)⑾掠蔚孜锒姿崃字＜〈?PIP2)的3'羥基磷酸化，使之成為PIP3，PIP3進(jìn)而促使AKT蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，并轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜，而活化后的AKT能夠激活下游靶基因，如Bcl-2、CyclinD1及MMPs等，進(jìn)而參與細(xì)胞的增殖、凋亡、細(xì)胞周期等生物學(xué)行為〔7〕。同時(shí)雌二醇能夠通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)控多種細(xì)胞的生物學(xué)行為〔8〕。本研究結(jié)果表明 10－8、10－7、10－6mmol/L 雌二醇能顯著提高BPH-1細(xì)胞活力，縮短G1期，下調(diào)Bax表達(dá)，上調(diào) Bcl-2、CyclinD1及 CyclinE表達(dá)，與激活PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)。