RhoA/Rho激酶信號(hào)通路在肺動(dòng)脈高壓中作用及尼索地平對(duì)其影響

杜梅素 岳春景 杜景霞 (邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，河北 邢臺(tái) 054000)

肺動(dòng)脈高壓(PH)是一種以肺血管阻力持續(xù)升高及內(nèi)膜重構(gòu)、增生為主要表現(xiàn)的一組疾病總稱(chēng)，是心血管領(lǐng)域常見(jiàn)的臨床綜合征，具有較高的發(fā)病率及死亡率〔1〕，主要位于血管中膜的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)易受到異常因素的刺激而轉(zhuǎn)化成合成型，并且從血管中膜轉(zhuǎn)移至內(nèi)膜進(jìn)行異常增殖〔2〕。5-羥色胺(HT)主要分布在血小板致密體內(nèi)，可以通過(guò)結(jié)合PASMCs上受體激活相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制來(lái)影響PASMCs增殖及凋亡，從而引起肺血管收縮〔3〕。Rho激酶(ROCK)能夠?qū)?xì)胞增殖及周期變化進(jìn)行調(diào)節(jié)，ROCK信號(hào)通路介導(dǎo)的各細(xì)胞功能在PH發(fā)生發(fā)展中起重要作用。該信號(hào)通路的激活主要與胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度、鈣調(diào)蛋白有關(guān)〔4〕，在目前應(yīng)用廣泛的抗 PH藥物中，鈣拮抗劑屬于較為常用的藥物之一，尼索地平(Nis)為二氫吡啶類(lèi)鈣拮抗劑，因此推測(cè)Nis是ROCK通路激活的重要抑制物質(zhì)。本文觀(guān)察ROCK信號(hào)通路在5-HT誘導(dǎo)的PASMCs增殖中變化及Nis對(duì)此變化的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠20只，體重200 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 5-HT(Sigma公司，美國(guó))，DEMF/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司，美國(guó))，胰蛋白酶(Amersco公司，美國(guó))，MTT(Serva公司，德國(guó))，磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶亞基(MYPT)1、p-MYPT1抗體(Upstate公司，美國(guó))，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(PIERCE 公司，美國(guó))，RhoA、ROCK、β-action(捷瑞生物工程公司，中國(guó))

1.3 PASMCs培養(yǎng)及鑒定〔5〕烏拉坦(20%，5 ml/kg)麻醉大鼠后將其斷頸處死后迅速開(kāi)胸處理，取出其肺組織后即刻在無(wú)菌條件下(超凈工作臺(tái)內(nèi))輕柔分離其肺動(dòng)脈主干及肺動(dòng)脈，解剖顯微鏡下用棉簽將肺動(dòng)脈周?chē)M織剪去后剝除纖維外膜及內(nèi)膜，用角膜剪將分離出的肺動(dòng)脈中膜反復(fù)剪碎剪成約0.5 mm×1.0 mm的小塊，將其平鋪于培養(yǎng)瓶瓶底，待其均勻分布后進(jìn)行原代培養(yǎng)，用含有20%胎牛血清的 DMFM-F12培養(yǎng)液在適宜環(huán)境下(37℃，5%CO2、21%O2、濕度 95%的培養(yǎng)箱內(nèi))靜置培養(yǎng)約24 h。當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞形成細(xì)胞暈后將上懸液及組織碎塊去除，在沉淀的細(xì)胞內(nèi)加入胰蛋白酶消化法將原代培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行消化分離后傳代培養(yǎng)。在同一視野內(nèi)利用倒置顯微鏡觀(guān)察分析相應(yīng)的細(xì)胞形態(tài)，SP法進(jìn)行α-actin免疫組化染色對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，并且選取第3～6代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PASMCs進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 MTT法檢測(cè)PASMCs增殖 將已配制的細(xì)胞懸液濃度調(diào)節(jié)為每升2×107個(gè)細(xì)胞，96孔板中每孔接種200 μl并培養(yǎng)24 h，細(xì)胞周期同步化處理后將其隨機(jī)分為對(duì)照組(1%胎牛血清培養(yǎng)基處理)、5-HT組(1%胎牛血清培養(yǎng)基中加入1 μmol/L的5-HT)及實(shí)驗(yàn)組(1、2、3、4 組)即 Nis 1×10-5mol/L、1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10－8mol/L 組，以上各組均設(shè)置 6 個(gè)平行孔。各實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行預(yù)處理，即先加入不同濃度的Nis，20 min 后加入 5-HT(1 μmol/L)，等待 1 d 從而使PASMCs能夠單層鋪滿(mǎn)孔底。完成后，每孔均加入MTT 液(5 g/L)20 μl，37℃孵育 4 h 后結(jié)束整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程。吸出培養(yǎng)液，通過(guò)添加200 μl二甲基亞砜，并在室溫環(huán)境下震蕩10 min，從而能夠溶解所有結(jié)晶，其中，假設(shè)波長(zhǎng)為490 nm時(shí)測(cè)定吸光度值。

1.5 RT-PCR測(cè)定RhoA及ROCK mRNA的表達(dá) 將同步化處理后的細(xì)胞隨機(jī)分組，分組方法同1.4，20 min后加入 5-HT(1 μmol/L)處理 30 min。完成后進(jìn)行消化分離各組細(xì)胞，從NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)中下載大鼠 RhoA、ROCK及 β-actin基因 cDNA的序列，其RhoA、ROCK及β-actin的上下游PCR擴(kuò)增引物采用Primer Premier5軟件進(jìn)行處理，同參考文獻(xiàn)〔2〕。對(duì)已進(jìn)行消化分離的各組細(xì)胞進(jìn)行總RNA的分離提取，對(duì)1 μg量的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄后取1 μg逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA進(jìn)行免疫熒光測(cè)定。其中，擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)變性4 min，94℃變性及53℃退火各40 s，72℃延伸90 s及10 min，共35個(gè)循環(huán)，重復(fù)3次。在進(jìn)行目的基因的測(cè)定過(guò)程中測(cè)定產(chǎn)物的灰度值，并且各組擴(kuò)增產(chǎn)物mRNA的表達(dá)量根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物與β-actin的變化倍數(shù)確定。

1.6 Western印跡檢測(cè)蛋白定量及MYPT1磷酸化水平 將同步化處理后的細(xì)胞隨機(jī)分為5-HT(1 μmol/L)處理 0、5、15、30、60、120 和 180 min 組，以確定5-HT作用最敏感的時(shí)間點(diǎn)。將同步化處理后的細(xì)胞隨機(jī)分組，分組方法同1.4，20 min后加入5-HT(1 μmol/L)處理15 min。處理結(jié)束后小心將培養(yǎng)液棄去，并且將100 μmol細(xì)胞裂解液RIPA加至各個(gè)培養(yǎng)皿中，1 μl的蛋白酶抑制劑，經(jīng)超聲處理2 min后置于冰上裂解60 min，通過(guò)在4℃下進(jìn)行1 200 r/min離心20 min，將各組細(xì)胞的漿蛋白提取后運(yùn)用BCA法(依據(jù)BCA試劑盒說(shuō)明書(shū))進(jìn)行蛋白定量，運(yùn)用裂解液將蛋白濃度規(guī)劃至同一水平后，依次加入反應(yīng)引物進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉，根據(jù)已測(cè)定的蛋白加樣量將60 μg等量蛋白電泳凝膠分離，結(jié)束后將膠板取出并分離，后再經(jīng)電轉(zhuǎn)(300 mA，70 min)至4℃的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜2 h，完成轉(zhuǎn)膜后將 PVDF膜漂洗1 min，含5%脫脂奶粉的等滲緩沖鹽溶液TBST在密閉的室溫環(huán)境下靜置1 h后注入一抗，并在環(huán)境溫度4℃下靜置一夜，在第二天通過(guò)洗膜液磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗10 min，重復(fù)3次，加入二抗后置于搖床上，在室溫下靜置1 h后，再次進(jìn)行重復(fù)洗膜，每次10 min，重復(fù)3次，結(jié)束后掃描PVDF膜成像。運(yùn)用相關(guān)軟件(ChemiDoc XRS成像系統(tǒng))對(duì)其蛋白進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果以所檢測(cè)蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值來(lái)表示。MYPT1磷酸化水平通過(guò) p-MYPT1與MYPT1的比值表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Nis對(duì)5-HT誘導(dǎo)的大鼠PASMCs增殖的作用大鼠PASMCs形狀呈長(zhǎng)梭形，平行束狀排列，呈波谷狀生長(zhǎng)。1 μmol/L的5-HT能促進(jìn)PASMCs增殖，而不同濃度的Nis均能夠抑制該種增殖，并且其抑制作用與Nis濃度相關(guān)，呈現(xiàn)出一定的濃度依賴(lài)性。

2.2 Nis對(duì)大鼠 PASMCs在5-HT作用下 RhoA及ROCK mRNA表達(dá)的影響 不同濃度Nis預(yù)處理均能降低5-HT誘導(dǎo)的PASMCs內(nèi)RhoA及ROCK mRNA升高，并且這種濃度差異和降低程度有一定關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。1×10-8mol/L的 Nis對(duì)ROCK mRNA表達(dá)仍有一定的降低作用，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組RhoA及ROCK mRNA表達(dá)(，n=6)

表1 各組RhoA及ROCK mRNA表達(dá)(，n=6)

與對(duì)照組相比:1)P＜0.05，與5-HT組相比:2)P＜0.05;表2同

組別 RhoA/β-actin ROCK/β-actin對(duì)照組 1.316±0.046 2.502±0.043 5-HT 組 4.261±0.0271) 5.363±0.7201)實(shí)驗(yàn)1組 1.532±0.1122) 2.693±0.0362)實(shí)驗(yàn)2組 1.693±0.0962) 2.742±0.0672)實(shí)驗(yàn)3組 2.874±0.1062) 3.003±0.1072)實(shí)驗(yàn)4組 3.102±0.1362) 4.078±0.0572)

2.3 Nis對(duì)大鼠PASMCs在5-HT作用下MYPT1磷酸化水平的影響 5-HT作用下大鼠PASMCs中胞質(zhì)染色均呈陽(yáng)性表現(xiàn)，且作用15 min時(shí)，胞質(zhì)染色陽(yáng)性表現(xiàn)最強(qiáng)。Nis作用后，與5-HT作用15 min組相比PASMCs中胞質(zhì)染色深度下降，呈弱陽(yáng)性。PASMCs中p-MYPT1在5-HT組呈現(xiàn)出明顯的增殖特征(P＜0.05)。不同濃度Nis的預(yù)處理不同程度地降低了5-HT誘導(dǎo)的PASMCs內(nèi)p-MYPT1表達(dá)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表 2。

表2 各組MYPT1及磷酸化水平(，n=6)

表2 各組MYPT1及磷酸化水平(，n=6)

組別 MYPT1/β-actin p-MYPT1/MYPT1對(duì)照組 1.215±0.503 1.362±0.201 5-HT 組 2.173±0.3231) 3.063±0.0301)實(shí)驗(yàn)1組 1.331±0.7622) 1.492±0.0152)實(shí)驗(yàn)2組 1.466±0.2632) 1.573±0.0272)實(shí)驗(yàn)3組 1.637±0.3522) 1.732±0.0102)實(shí)驗(yàn)4組 1.833±0.4322) 2.335±0.0012)

3 討論

PH是在各種因素作用下以血管平滑肌細(xì)胞增殖、肥大從而引起血管重塑及肺血管阻力進(jìn)行性升高為主要病理改變的一種原發(fā)或繼發(fā)性疾病〔6〕。平滑肌細(xì)胞增殖等改變能夠引起血管內(nèi)徑及管壁厚度隨之發(fā)生與病理環(huán)境相適應(yīng)的改變〔7〕，若這種改建超出機(jī)體生理性的承受范圍，則會(huì)存在一定的危險(xiǎn)性。因此，在一定程度上對(duì)PASMCs增殖改變進(jìn)行抑制可以對(duì)肺血管重構(gòu)起到改善的作用。

5-HT是生物體內(nèi)的一種生物胺，能夠通過(guò)相應(yīng)受體誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制〔8〕，在它的介入下，酪氨酸激酶的活性得到提升，導(dǎo)致酪氨酸形成磷酸類(lèi)化合物，最終加快了細(xì)胞有絲分裂的速度，從而調(diào)節(jié)PASMCs增殖與凋亡。在平滑肌細(xì)胞和肺血管內(nèi)膜中有一種可以運(yùn)載5-HT的膜蛋白，即5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體(5-HTT)。5-HT通過(guò)5-HTT主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)使其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與相應(yīng)受體結(jié)合后，使細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中Ca2+濃度明顯升高，使其細(xì)胞增殖的相關(guān)信號(hào)被開(kāi)啟，這可能是其誘導(dǎo)形成PH的主要機(jī)制之一。本研究表明5-HT對(duì)PASMCs增殖有明顯促進(jìn)作用，也證實(shí)了以上觀(guān)點(diǎn)。

RhoA主要通過(guò)與下游的效應(yīng)分子Rho激酶相結(jié)合而發(fā)揮重要的作用〔9〕，對(duì)于廣泛存在于體內(nèi)各個(gè)組織細(xì)胞的RhoA/Rho激酶來(lái)說(shuō)，由于其具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的功能，因此該信號(hào)通路被過(guò)度激活時(shí)能夠誘發(fā)PASMCs發(fā)生有絲分裂或協(xié)同有絲分裂，平滑肌細(xì)胞增殖，從而導(dǎo)致肺血管的重構(gòu)，同時(shí)肺血管阻力呈進(jìn)行性增加。以往研究表明，RhoA蛋白活性增強(qiáng)的過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)的鈣調(diào)蛋白及Ca2+的濃度發(fā)揮了重要的作用，而 Ca2+充分扮演了第二信使的作用，能誘發(fā)PASMCs的興奮-收縮耦聯(lián)機(jī)制及興奮-轉(zhuǎn)錄機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)肺血管的收縮及增加細(xì)胞因子的表達(dá)來(lái)促進(jìn)肺血管重塑〔10，11〕。本實(shí)驗(yàn)中，5-HT 對(duì)于大鼠 PASMCs 內(nèi)ROCK和RohA mRNA的表達(dá)具有增強(qiáng)作用，但Nis對(duì)這一現(xiàn)象有明顯的抑制作用，并且該抑制作用與Nis自身濃度呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性，與以往研究相符〔2〕。在RhoA的下游，ROCK不僅能夠發(fā)揮靶效應(yīng)，而且由于其活性得到激發(fā)，還能促使其下游的MYPT1產(chǎn)生磷酸性化合物，使其失去活性，并最終使得細(xì)胞的增殖、衰敗、遷移及黏附等生物學(xué)行為和功能受到破壞〔12〕。因而，大鼠PASMCs內(nèi)MYPT1磷酸化與ROCK活化程度有較大相關(guān)性。隨著作用時(shí)間的增加，大鼠PASMCs內(nèi)MYPT1磷酸化水平逐漸增加，這充分表明了在5-HT誘導(dǎo)PASMCs異常增殖的過(guò)程中，RhoA/Rho激酶信號(hào)通路發(fā)揮了重要作用，并且不同濃度的Nis均明顯能夠降低MYPT1的磷酸化程度，對(duì)ROCK活化起到了抑制作用，且在最低濃度的作用下其磷酸化水平仍有所下降，進(jìn)一步證明了 Nis能夠抑制RhoA/ROCK(RhoA/Rho激酶)信號(hào)通路的作用。

綜上，5-HT作用下PH大鼠PASMCs存在增殖及RhoA/Rho激酶信號(hào)通路的異常表現(xiàn)，Nis能夠抑制該細(xì)胞的異常增殖并調(diào)節(jié)信號(hào)通路的表達(dá)，防止肺血管重構(gòu)。