持續(xù)性心房顫動模型犬左心房肌HCN2和HCN4通道表達變化

張 健 李發(fā)鵬 何 衛(wèi) 李耀東 甘天翊 湯寶鵬 (新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟中心，新疆 烏魯木齊 830054)

心房顫動也稱心房纖顫，簡稱房顫，其發(fā)病率會隨著年齡的增長逐漸增長〔1〕，尤其在老年人群中發(fā)病率較中青年人群明顯增高〔2，3〕。房顫危害程度很高，極容易形成血栓導(dǎo)致臟器受損或致殘。因此，迫切需要研究其發(fā)病機制，進而從分子生物學(xué)水平為臨床提供有力的證據(jù)支持。

無論是陣發(fā)性房顫還是持續(xù)性房顫，最終均有可能發(fā)展成永久性房顫。陣發(fā)性房顫如果持續(xù)發(fā)生，也會變?yōu)槌掷m(xù)性房顫，即所謂“房顫誘發(fā)房顫 ”機制〔4〕，并且這一發(fā)展過程往往會呈一種進行性發(fā)展趨勢。因此，筆者認(rèn)為房顫發(fā)生的本質(zhì)是心房電重構(gòu)〔4〕。既往研究顯示〔5〕，房顫發(fā)生過程中，由于心房電生理和結(jié)構(gòu)發(fā)生了一系列改變，進而使得房顫波發(fā)生或復(fù)發(fā)，進而形成心房重構(gòu)。電重構(gòu)指的是心房肌的心肌細(xì)胞由于動作電位的時程變化進而導(dǎo)致的離子通道改變，由于離子通道改變進而導(dǎo)致心房肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生改變〔4〕，這一特征為電重構(gòu)的早期表現(xiàn)。Lubitz等〔5，6〕曾先后提出心房電重構(gòu)的概念，奠定了房顫心房電重構(gòu)的理論。研究證實〔6〕，電重構(gòu)的基礎(chǔ)是離子通道的重構(gòu)，而超極化激活環(huán)核苷酸門控(HCN)通道能使心房肌或心室肌的自律性增高，并且HCN通道與心律失常的發(fā)生和維持有著密切聯(lián)系。HCN通道的研究目前逐漸成為預(yù)防心律失常的一個新熱點。本研究分析持續(xù)性房顫形成過程中心房肌HCN2和HCN4通道表達的改變，進而從分子生物學(xué)水平闡釋持續(xù)性房顫的發(fā)生與HCN2和HCN4通道之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 健康雌雄各半比格犬12只，體重12～15.5 kg，平均(15.1±2.4)kg，平均年齡(1.4±0.6)歲。分為持續(xù)性房顫模型犬(實驗組)6只，平均年齡(1.48±0.45)歲，平均體重(14.3±2.6)kg;竇性心律模型犬(對照組)6只，平均年齡(1.46±0.36)歲，平均體重(14.7±2.1)kg。新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實驗中心已經(jīng)通過AAALAC認(rèn)證，全部實驗犬由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實驗中心提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物的準(zhǔn)備和麻醉 健康比格犬禁食水12 h，使用鹽酸氯胺酮注射液行基礎(chǔ)麻醉，然后將比格犬背部朝下，肚皮朝上，用繃帶將四肢固定在大動物手術(shù)臺上。調(diào)整好呼吸機參數(shù)，麻醉后的比格犬行氣管插管，外接呼吸機輔助呼吸，同時持續(xù)使用麻醉藥及肌松藥維持麻醉狀態(tài)并使其處于肌松狀態(tài)〔7〕。胸部剃毛后貼電極片，采心電圖，四肢接自制醫(yī)用銀針，將銀針刺入四肢皮下組織，外接監(jiān)護儀。實驗過程需密切監(jiān)測比格犬的生命體征。

1.2.2 持續(xù)性房顫犬模型的制作 犬四肢固定、消毒、鋪洞巾。從胸骨右側(cè)第4～5肋間隙進行切口，用開胸器沿肋骨間隙將肋骨撐開。將心包剪開，在右心耳底部固定起搏電極，測試起搏的電壓閾值及電極阻抗，電壓閾值應(yīng)該小于 1 mV，阻抗應(yīng)該在 500～1 000 Ω。分離囊袋后將動物用高頻心臟起搏器與已經(jīng)測試合格的起搏器電極相連，用磁鐵在體外開啟起搏器，心電圖證實起搏器開啟正常，然后予600次/min的頻率連續(xù)起搏8 w〔8〕。竇性心律組僅作開胸手術(shù)植入起搏器，不開啟起搏器。

1.2.3 誘發(fā)房顫 模型犬在該院動物養(yǎng)育中心認(rèn)真喂養(yǎng)，8 w后關(guān)閉起搏器。如果關(guān)閉起搏器后有房顫則為自發(fā)性房顫，這種模型犬可以立刻用于實驗。如果8 w后關(guān)閉起搏器無法誘發(fā)房顫，則需要誘發(fā)房顫。心臟電生理檢查基本技術(shù)和方法中程序刺激分三種:①分級遞增刺激;②短陣快速刺激(Burst刺激);③程序期前刺激。本文誘發(fā)房顫的方法為Burst刺激法。首先分別使用400 ms和300 ms的驅(qū)動周長作為誘發(fā)的期前程序刺激，這種刺激也被稱為S1S1。之后需要心房有效不應(yīng)期加上30 ms的S1S2反掃，心臟電生理檢查反掃步長的時間為10 ms。如果以上方法仍舊無法誘發(fā)房顫，則需要引用S3，引用的S3與S2一起構(gòu)成S2S3，同樣以10 ms的步長進行反掃，但是需要注意，在組成S2S3時，它的間期應(yīng)該從S1S2的80%開始。以此方法，如果仍舊不能誘發(fā)房顫，需要引入S4，反掃方法同前所述。如果通過以上方法仍無房顫發(fā)生，應(yīng)加大舒張期閾值，強度可以設(shè)置為正常值的2倍，只有持續(xù)時間大于15 min的房顫才能定義為持續(xù)性房顫，誘發(fā)時間不足15 min的房顫只能定義為陣發(fā)性房顫〔9〕。本實驗的模型犬需要誘發(fā)時間大于15 min以上的房顫，即持續(xù)性房顫。

1.2.4 采集標(biāo)本 實驗結(jié)束后迅速開胸，本著人道主義方法獲取犬心臟標(biāo)本。將實驗組及對照組犬的心臟固定，用止血鉗夾住心臟大血管，快速使用手術(shù)剪緊靠止血鉗剪下心臟，分別將左右心房和左右心室分離。本實驗使用犬的心房組織，將左心耳從心房組織中分離，迅速放入凍存管中標(biāo)注清楚，之后快速投入液氮中速凍，－80℃超低溫冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測左心房肌HCN2和HCN4通道的表達 (1)－80℃超低溫冰箱中取去除血液及脂肪組織的左心耳標(biāo)本共100 mg，由Invitrogen公司提供的Trizol提取總RNA。取2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒由Promega公司A3500提供。(2)引物設(shè)計與合成:由TaKaRa公司合成引物，其中引物的設(shè)計和合成詳見文獻〔10〕。(3)進行Real-time PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系由上海睿安生物提供:cDNA 2 μl，SybrGreen qPCR Master Mix 12.5 μl，上、下游引物各 0.5 μl，ddH2O 9.5 μl。(4) 反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃，2 min;變性 95℃ 10 s，進入 PCR 循環(huán)，共 40個循環(huán)〔10〕。退火溫度在 HCN2，61℃;HCN4，56℃;β-actin，60℃;30 s;40 s的延伸。HCN2、HCN4 作為目標(biāo)基因，它們的mRNA相對表達含量依據(jù)Ct值計算得出。HCN2 產(chǎn)物 片段 141 bp;HCN4，208 bp;β-actin，186 bp。(5)配制雙層聚丙烯酰胺凝膠，通過BIO-RAD凝膠成像獲得電泳圖:使用5 μl用2%瓊脂糖凝膠，將目標(biāo)基因PCR產(chǎn)物進行電泳成像，之后再行掃描成像，獲得的電泳圖便是目標(biāo)基因產(chǎn)物的電泳圖。

1.2.6 Western印跡檢測左心房肌HCN通道各蛋白的表達 首先浸膜，之后將帶有膜的封閉液置于搖床上1 h，最佳溫度20～25℃。組織總蛋白提取試劑盒，北京索來寶公司提供。將膜與HCN2和HCN4通道蛋白特異性一抗即兔抗IgG混合，一抗由英國Abcam公司生產(chǎn)，稀釋比例1∶2 000;之后需要孵育，孵育后洗膜3次，將洗好的膜與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的特異性二抗(即山羊抗兔-IgG，由武漢博士德公司提供)結(jié)合進行孵育特異對照產(chǎn)物β-actin通道蛋白特異性一抗是兔抗IgG，由武漢博士德公司提供，其他反應(yīng)及孵育條件相同。

組織總蛋白提取試劑盒和一抗及二抗均嚴(yán)格按照操作說明書進行，按照聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法測定總蛋白含量。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離總蛋白，然后將膠上的蛋白通過電轉(zhuǎn)印跡到硝酸纖維素膜(NC)膜上。5%脫脂奶粉/Tris緩沖鹽溶液(TBS)液封閉、洗脫后，分別加入特異性一抗進行雜交，4℃孵育過夜，經(jīng)特異性二抗(山羊抗兔-IgG，武漢博士德公司)孵育1 h，進行二氨基聯(lián)苯胺(DBA)顯色，BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)進行掃描定量。每張膜需要依據(jù)內(nèi)參值測定目標(biāo)值表達含量，目標(biāo)基因HCN2(或HCN4)的蛋白相對表達含量為HCN2吸光度值/β-actin吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件行t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 模型完成情況 12只犬全部順利完成實驗。模型組在快速起搏8 w后3只出現(xiàn)自發(fā)性房顫，5只誘發(fā)出持續(xù)性房顫，Burst刺激全部(100%)誘發(fā)持續(xù)性房顫，平均房顫持續(xù)時間(51±13)min。

2.2 HCN通道各亞單位的PCR產(chǎn)物 擴增出的產(chǎn)物未發(fā)現(xiàn)HCN1表達，而β-actin、HCN2、HCN4的PCR產(chǎn)物的電泳帶位置分別位于152 bp、143 bp、132 bp，與理論值相符。見圖1。

圖1 目標(biāo)基因電泳圖

2.3 HCN通道各亞單位的mRNA表達 與對照組相比，實驗組心房肌中HCN2、HCN4 mRNA表達增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 兩組心房肌HCN2 HCN4 mRNA表達水平比較(，n=6)

表1 兩組心房肌HCN2 HCN4 mRNA表達水平比較(，n=6)

組別 HCN2 HCN4對照組 1.25±0.11 1.12±0.16實驗組 2.22±0.22 2.97±0.23 P值 0.03 0.01

2.4 兩組心房肌HCN2和HCN4通道蛋白表達 實驗組心房肌組織中HCN2、HCN4蛋白含量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 兩組心房肌HCN2和HCN4通道蛋白表達水平比較(，n=6)

表2 兩組心房肌HCN2和HCN4通道蛋白表達水平比較(，n=6)

組別 HCN2 HCN4對照組 0.27±0.04 0.42±0.06實驗組 0.51±0.06 0.68±0.11 P值 0.03 0.01

3 討論

HCN通道又稱超級化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道，與環(huán)核苷酸門控(CNG)通道具有高度的同源性;兩者均為細(xì)胞膜上的一種特殊結(jié)合蛋白，前者可以控制Na+和K+通道，即鈉-鉀通道，后者可以控制鉀通道。該通道各亞基具有高度選擇的親水性，通過控制鈉、鉀通道閘門的開啟和關(guān)閉過程進而控制HCN通道的開放和關(guān)閉。HCN通道目前有4個亞基(HCN1、HCN2、HCN3、HCN4)，6個跨膜片段，其中 S4 為電壓感受器〔11〕，通過控制離子流還可以掌控通道的激活、失活和關(guān)閉狀態(tài)。在每個亞基的6個跨膜片段中有2個跨膜片段是離子通透孔道，C端的環(huán)核苷酸結(jié)合區(qū)域CNBD可以與環(huán)磷酸腺苷(cAMP)結(jié)合，通過結(jié)合cAMP反過來進一步調(diào)節(jié)HCN通道，達到一種共同作用的效果。

雖然HCN通道是電壓依賴性門控通道，具有其獨特的電生理特性〔12〕，但HCN通道的所有亞基均具有4個基本的共同特征:超極化激活特征，能被銫離子阻斷的特征，電流均可以通過K+和Na+離子共同攜帶的特征，可受(cAMP)反向調(diào)控的特征〔13～16〕。If電流是心臟起搏電流的重要組成部分〔10〕，HCN通道和野生型If離子通道有相似的分子生物學(xué)結(jié)構(gòu)和通道動力學(xué)特征。既往研究發(fā)現(xiàn)，在心房增大的動物模型及人的心房組織中隨著If電流增大，HCN通道表達增多，由于If離子流的增大或減少，最終會導(dǎo)致各種心律失常。通過影響If電流進而使HCN2和HCN4 mRNA表達明顯上調(diào)〔10，16〕。

本實驗結(jié)果提示快速心房起搏導(dǎo)致了心房內(nèi)的HCN通道發(fā)生重構(gòu)，之后通過影響HCN2和HCN4的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，使得二者的表達上調(diào)，局部心房肌的自律性增高，從而導(dǎo)致房顫的易發(fā)生和維持。

本實驗的局限性是僅測定持續(xù)性房顫時目標(biāo)基因的mRNA及蛋白水平，后期會針對房顫的離子通道電流進行研究。