Wnt信號(hào)通路在狼瘡性腎炎發(fā)病過程中的作用

孫鐵霖 李 里 宮 亮 (錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 00)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種由于免疫系統(tǒng)功能紊亂，產(chǎn)生大量的自身抗體，進(jìn)而對(duì)各個(gè)系統(tǒng)臟器產(chǎn)生破壞的自身免疫性疾病。在遺傳因素、環(huán)境因素、雌激素水平等各種因素相互作用下，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞減少、T細(xì)胞功能降低、B細(xì)胞過度增生，產(chǎn)生大量的自身抗體，并與體內(nèi)相應(yīng)的自身抗原結(jié)合形成相應(yīng)的免疫復(fù)合物，沉積在皮膚、關(guān)節(jié)、小血管、腎小球等部位。在補(bǔ)體的參與下，引起急慢性炎癥及組織壞死(如狼瘡性腎炎)，或抗體直接與組織細(xì)胞抗原作用，引起細(xì)胞破壞(如紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及血小板壁的特異性抗原與相應(yīng)的自身抗體結(jié)合，分別引起溶血性貧血、淋巴細(xì)胞減少癥和血小板減少癥)，從而導(dǎo)致機(jī)體的多系統(tǒng)損害。其中累及腎臟引起的狼瘡性腎炎最為常見，狼瘡性腎炎的嚴(yán)重程度及治療效果是評(píng)估預(yù)后的主要因素〔1〕。在狼瘡腎炎的治療中，仍然以激素及免疫抑制劑聯(lián)合治療為主。目前治療狼瘡性腎炎是否有其他的治療手段仍是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。Wnt/β-catenin是重要的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，Wnt糖蛋白同F(xiàn)z蛋白受體結(jié)合，在細(xì)胞表面聚集，進(jìn)而激活β-catenin聚集，發(fā)揮作用〔2〕。以往研究表明該通路在胚胎形成發(fā)育過程及纖維化過程均發(fā)揮重要作用。目前最新觀察發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin通路可能參與狼瘡性腎炎的發(fā)病過程〔3〕。本研究探討Wnt/β-catenin在狼瘡性腎炎發(fā)病過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 2013～2015年錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院行腎活檢的狼瘡性腎炎患者42例，年齡51～67歲。入選患者均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)，在11項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)中符合至少4項(xiàng)，且均有腎臟受累表現(xiàn)。收集患者臨床資料SLE活動(dòng)指標(biāo)(SLEDAI)積分評(píng)估疾病活動(dòng)度?；颊呔心I活檢，其中病理分型Ⅲ型4例，Ⅳ型13例和Ⅴ型25例。另取16例腎癌手術(shù)患者，男7例，女9例，年齡50～68歲，平均65.1歲。取腎癌旁的正常組織(距腫瘤組織2～5 cm)作為對(duì)照組。

1.2 應(yīng)用Western印跡法檢測(cè)腎臟活檢標(biāo)本中βcatenin蛋白的表達(dá) 收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，1 500 r/min離心5 min。加入適量三去污細(xì)胞裂解液，充分混勻，冰上超聲波碎裂后，放置30 min;4℃，12 000 r/min離心20 min，吸取上清以考馬斯亮藍(lán)測(cè)定蛋白樣品濃度。將蛋白質(zhì)樣品與凝膠加樣緩沖液均勻混合，煮沸變性5 min，－80℃保存?zhèn)溆谩Ｓ? ml加樣器將混合液加入玻璃板夾心的凝固的分離膠上面，直至夾層頂部。立即將0.75 mm的梳齒插入夾層頂部的濃縮膠中，室溫靜置30 min。待膠凝固后置于－4℃保存，第2天備用。電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液后，用微量加樣器低溫條件下將制好的蛋白樣品上樣，每孔上樣量為100 μg，80 V電壓，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至分離膠底部，關(guān)閉電源。經(jīng)過SDS電泳后，經(jīng)過硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)印，檢測(cè)β-catenin蛋白表達(dá)。其中β-catenin單克隆抗體的稀釋度為1∶2 000，辣根過氧化物酶標(biāo)記的馬抗羊抗體稀釋度為 1∶1 000。用β-catenin的灰度值表示 β-catenin的相對(duì)表達(dá)水平。以β-actin為內(nèi)參對(duì)照產(chǎn)物進(jìn)行半定量分析。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定β-catenin mRNA在腎臟活檢標(biāo)本中的表達(dá) 將各組細(xì)胞中加入1 ml裂解液，充分混勻，在室溫下放置5 min。加入200 μl氯仿，蓋好管蓋，渦旋振蕩器充分振蕩15 s，室溫放置3 min。4℃12 000 r/min離心10 min，樣品分成三層:黃色的有機(jī)相、中間層和無色的水相，RNA主要在水相中，水相的體積約為所用裂解液RZ試劑的50%。把水相轉(zhuǎn)移到新管中，進(jìn)行下一步操作。緩慢加入0.5倍體積無水乙醇，混勻(此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)沉淀)。將得到溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱3中，4℃ 12 000 r/min離心30 s，棄掉收集管中的廢液。向吸附柱3中加入500 μl去蛋白液，4℃ 12 000 r/min離心30 s，棄廢液。向吸附柱3中加入 500 μl漂洗液，室溫靜置 2 min，4℃12 000 r/min離心30 s，去除殘余液體。將吸附柱放入1.5 ml收集管中，4℃ 12 000 r/min離心2 min，去除殘余液體。將吸附柱CR3轉(zhuǎn)入一個(gè)新的離心管中，加40 μl無 水 RNase ddH2O，室 溫 放 置 2 min，4℃12 000 r/min離心2 min，所得到的即樣本總RNA。置于－70℃冰箱保存。將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，具體方法參照逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒說明，提取10 μl cDNA，37℃ 15 min，85℃ 5 min，至40℃。mRNA 表達(dá)水平檢測(cè)采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，β-catenin引物:上游:5＇-GGCTTCTGATAAAGGGTACTGTTG-3＇，下游:5 ＇-ACGCAAAGGTGCATGATTTG-3＇，β-actin 作為內(nèi)參照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件行單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 狼瘡性腎炎患者基本臨床資料及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果 狼瘡性腎炎患者以年輕女性發(fā)病為主，病理分型以Ⅴ型多見，Ⅴ型SLEDAI積分明顯較低，Ⅴ型的24 h尿蛋白及血清肌酐水平較Ⅳ型均明顯降低(P＜0.05)，Ⅴ型補(bǔ)體C3較Ⅳ型明顯升高(P＜0.05)，見表1。

表1 狼瘡性腎炎患者臨床及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果()

表1 狼瘡性腎炎患者臨床及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果()

與Ⅳ型相比:1)P＜0.05

組別 n 男/女(n) 年齡(歲)SLEDAI積分(分)24 h尿蛋白(g/d)血清肌酐(μmol/L)CRP(mg/L)補(bǔ)體C3(g/L)補(bǔ)體C4(g/L)IgG(g/L)IgA(g/L)Ⅲ型 4 0/4 61.7±10.2 8.98±3.9 4.38±3.2 61.6±17.7 5.0±4.3 0.59±0.31 0.11±0.11 12.3±18.0 1.94±1.0Ⅳ型 13 0/13 67.0±13.9 8.79±3.5 4.18±3.1 97.4±65.1 4.1±2.1 0.42±0.19 0.06±0.04 7.7±3.8 1.97±0.7Ⅴ型 25 3/22 64.2±11.8 6.98±3.41) 2.38±1.91) 53.1±17.31) 5.9±8.6 0.63±0.231) 0.11±0.07 11.0±6.2 2.53±1.1合計(jì) 42 3/39 65.1±10.1 7.98±3.6 2.98±2.9 67.4±42.7 5.1±6.5 0.55±0.24 0.09±0.07 10.3±5.5 2.27±1.0

2.2 β-catenin蛋白在腎臟活檢標(biāo)本中的表達(dá) βcatenin蛋白在狼瘡性腎炎患者腎組織標(biāo)本中的表達(dá)(0.586±0.123)明顯高于對(duì)照組(0.081±0.019)(P=0.003)。β-catenin蛋白在Ⅴ型狼瘡性腎炎患者的表達(dá)(0.798±0.715)較Ⅳ型(0.503±0.823)及Ⅲ型(0.592±0.113)明顯升高(P＜0.05);Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型均明顯高于對(duì)照組(P=0.020、0.039、0.003)。

2.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)腎臟活檢標(biāo)本中β-catenin mRNA 狼瘡性腎炎組腎臟 β-catenin mRNA表達(dá)(3.096±0.123)較對(duì)照組(2.031±0.211)明顯升高(P=0.009)，其中Ⅴ型β-catenin mRNA表達(dá)(3.616±0.116)較Ⅳ型(2.698±0.168)及Ⅲ型(2.913±0.294)明顯升高(P＜0.05);Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型均明顯高于對(duì)照組(P=0.031、0.011、0.007)。

3 討論

狼瘡性腎炎按病理分型有6種:Ⅰ型主要是輕微的病變，Ⅱ型是系膜性，Ⅲ型是局灶性，Ⅳ型是彌漫性，Ⅴ型是膜性，Ⅵ是腎臟病變嚴(yán)重，大部分硬化、纖維化;以上的分型會(huì)轉(zhuǎn)化〔4〕。本實(shí)驗(yàn)收集的Ⅴ型腎炎腎損害較Ⅳ型腎炎輕，這與之前臨床研究發(fā)現(xiàn)的Ⅳ型腎炎較其他類型腎炎表現(xiàn)更重的觀點(diǎn)一致〔5〕。

Wnt信號(hào)通路包括經(jīng)典和非經(jīng)典通路，Wnt/βcatenin通路為經(jīng)典通路。在該信號(hào)通路中β-catenin處于中心位置，當(dāng)Wnt通路沒有被激活時(shí)，β-catenin殘基被糖原合成激酶(GSK)-3β磷酸化，β-catenin被降解，使得胞內(nèi)β-catenin數(shù)量穩(wěn)定。當(dāng)Wnt通路被激活時(shí)，一些因素使得GSK-3β活性被抑制，GSK-3β無法使 β-catenin 磷酸化和降解〔6，7〕。當(dāng)細(xì)胞內(nèi) β-catenin數(shù)量增加到一定程度，就會(huì)與信號(hào)通路T細(xì)胞因子(TCF)/淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子(LEF)結(jié)合，進(jìn)而激活Snail、Twist等，使得某些特定基因出現(xiàn)表達(dá)增強(qiáng)和減弱。Wnt信號(hào)通路在胚胎時(shí)期腎臟發(fā)育發(fā)揮了重大的作用，主要參與腎單位及腎小管的發(fā)育，尤其在腎小管發(fā)育的最初階段發(fā)揮重要作用。另外多項(xiàng)研究表明，Wnt信號(hào)通路參與了多囊腎病及腎囊腫的形成〔8，9〕。在腎細(xì)胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)，β-catenin的活化受到抑制，表明Wnt/β-catenin在腎細(xì)胞癌發(fā)病中被激活。在腎間質(zhì)纖維化的模型中同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了β-catenin的高表達(dá)〔10〕。雖然Wnt/β-catenin通路在多種腎臟疾病中出現(xiàn)了異常表達(dá)，但在狼瘡腎炎患者上的研究目前并無報(bào)道。Tveita等〔3〕的研究表明狼瘡性腎炎的發(fā)病中可能存在Wnt通路參與。分析原因，在狼瘡性腎炎的發(fā)病過程中某種因素激活了Wnt信號(hào)通路，進(jìn)而使細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)表達(dá)增加，使得細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生重建，在不斷的修復(fù)與重建中，狼瘡性腎炎形態(tài)學(xué)變化就出現(xiàn)了〔6，11〕。

Tveita 等〔12，13〕在狼瘡鼠模型中發(fā)現(xiàn)，MMP-2 和MMP-9表達(dá)及活性升高，其中MMP-9的表達(dá)水平與狼瘡鼠的雙鏈(ds)-DNA水平呈負(fù)相關(guān)。

本研究推測(cè)在狼瘡性腎炎的發(fā)病過程中，可能激活了Wnt通路，該通路進(jìn)而參與了狼瘡性腎炎的發(fā)病，Ⅴ型狼瘡性腎炎的發(fā)病過程中該通路起著更大的作用。以上研究結(jié)果與 Tveita等〔12，13〕研究相似，其在狼瘡鼠模型NZB/NZW中發(fā)現(xiàn)，β-catenin mRNA表達(dá)水平在蛋白尿期明顯升高，認(rèn)為Wnt/β-catenin通路可能對(duì)狼瘡性腎炎起重要調(diào)節(jié)作用。