閉鎖蛋白和閉鎖小帶蛋白在慢性胃炎組織中的表達(dá)和意義

陳 俊 張 慧 張瓊慧 李俊紅 徐桂濤 徐衛(wèi)華

湖北孝昌縣第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科(432900)

背景：慢性胃炎發(fā)病的過程中，生物因子的改變可影響胃黏膜的生理屏障，增加細(xì)胞間連接的損傷風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致黏膜上皮屏障破壞。目的：探討閉鎖蛋白(occludin)、閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)在慢性胃炎組織中的表達(dá)和意義。方法：選取2014年10月—2017年10月于孝昌縣第一人民醫(yī)院就診的慢性胃炎患者82例，根據(jù)內(nèi)鏡活檢病理結(jié)果分為慢性非萎縮性胃炎(CNAG)組和慢性萎縮性胃炎(CAG)組，選取同期健康志愿者40名作為正常對照組。采用免疫組化方法檢測胃黏膜組織occludin、ZO-1表達(dá)。幽門螺桿菌(Hp)陽性患者給予Hp根除治療，轉(zhuǎn)陰者復(fù)查occludin、ZO-1表達(dá)。結(jié)果：CNAG、CAG組occludin、ZO-1蛋白陽性表達(dá)率顯著低于正常對照組(P<0.05)；CNAG組occludin、ZO-1蛋白陽性表達(dá)率顯著高于CAG組(P<0.05)。CNAG Hp陽性組occludin、ZO-1蛋白陽性表達(dá)率顯著低于Hp陰性組(P<0.05)；CAG Hp陽性組ZO-1蛋白陽性表達(dá)率顯著低于Hp陰性組(P<0.05)。Occludin、 ZO-1蛋白表達(dá)與胃黏膜炎癥活動度呈線性趨勢關(guān)系(P<0.05)，隨著炎癥活動度的增加，兩者表達(dá)顯著減弱。CNAG Hp陽性患者轉(zhuǎn)陰后，occludin、ZO-1蛋白陽性表達(dá)率較根除治療前顯著升高(P<0.05)。結(jié)論：Occludin、ZO-1在慢性胃炎組織尤其是CAG中表達(dá)減弱。兩者表達(dá)與Hp感染以及胃炎活動度之間存在一定聯(lián)系。

慢性胃炎發(fā)病的過程中，生物因子的改變可影響胃黏膜的生理屏障，增加細(xì)胞間連接的損傷風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致黏膜上皮屏障破壞。閉鎖蛋白(occludin)是重要的細(xì)胞跨膜成分，作為細(xì)胞間緊密連接蛋白之一，參與細(xì)胞屏障功能和維持細(xì)胞極性。閉鎖小帶蛋白-1(zonula occluden-1, ZO-1)則是緊密連接的骨架成分，可連接occludin與細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白，在緊密連接與細(xì)胞內(nèi)成分相連中起橋梁作用[1]。本研究通過檢測occludin、ZO-1在慢性萎縮性胃炎(CAG) 、慢性非萎縮性胃炎(CNAG)患者胃黏膜組織中的表達(dá)，旨在為慢性胃炎的臨床診治提供理論依據(jù)。

對象與方法

一、研究對象

選取2014年10月—2017年10月于湖北孝昌縣第一人民醫(yī)院就診的慢性胃炎患者82例，根據(jù)內(nèi)鏡活檢病理結(jié)果分為CNAG組和CAG組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)電子胃鏡檢查確診；②入組前3個(gè)月內(nèi)未服用非甾體消炎藥、抗菌藥物、鉍劑；③經(jīng)快速尿素酶試驗(yàn)(RUT)明確幽門螺桿菌(Hp)感染狀態(tài)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①胃大部切除術(shù)史；②活動性上消化道出血、嚴(yán)重心肺疾病、消化道穿孔等疾?。虎蹮o法耐受胃鏡檢查。選取40名同期健康志愿者作為正常對照組。根據(jù)RUT結(jié)果進(jìn)一步將CNAG、CAG患者分別分為Hp陽性組和陰性組。研究方案經(jīng)湖北孝昌縣第一人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，入組者均簽屬知情同意書。

二、方法

1. 免疫組化染色：胃黏膜內(nèi)鏡活檢標(biāo)本石蠟切片脫蠟至水，反復(fù)洗滌，加入牛奶液體封閉5 min，加入occludin、ZO-1 抗體(Abcam公司，滴度均為1∶1 000)， 37 ℃孵育2 h，PBS洗滌3次，加入熒光標(biāo)記的二抗(Abcam公司)，37 ℃ 孵育 30 min，PBS洗滌，DAB顯色，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。以PBS代替一抗作為陰性對照。

結(jié)果判斷：Occludin、ZO-1陽性表達(dá)定位于細(xì)胞膜，陽性細(xì)胞比例<5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，≥76%為4分；無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分?？偡譃殛栃约?xì)胞比例評分與染色強(qiáng)度評分的乘積，≤6分為陰性表達(dá)，≥7分為陽性表達(dá)。

2. 胃黏膜炎癥活動度分級：參照《中國慢性胃炎共識意見(2006，上海)》中的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級[2]。

3. Hp根除治療：對Hp陽性患者給予Hp根除治療(鉍劑四聯(lián)療法)。治療結(jié)束后4～6周行13C-尿素呼氣試驗(yàn)，CNAG組Hp轉(zhuǎn)陰患者復(fù)查胃黏膜occludin、ZO-1表達(dá)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、 一般情況

82例患者中CNAG組44例，其中男27例，女17例，年齡30～69歲 ，平均(55.0±9.2)歲；CAG組38例，其中男20例，女18例，年齡29～70歲 ，平均(54.8±8.4)歲。正常對照組40例，其中男25例，女15例，年齡30～70歲 ，平均(55.1±9.1)歲。三組間性別構(gòu)成、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

二、CNAG、CAG患者occludin、ZO-1蛋白表達(dá)情況

CNAG、CAG組occludin、ZO-1蛋白陽性表達(dá)率顯著低于正常對照組(P<0.05)；CNAG組occludin、ZO-1蛋白陽性表達(dá)率顯著高于CAG組(P<0.05)(表1)。

三、Hp陽性與陰性CNAG、CAG患者occludin、ZO-1蛋白表達(dá)情況

CNAG患者中Hp陽性21例，Hp陰性23例。Hp陽性組occludin、ZO-1蛋白陽性表達(dá)率顯著低于Hp陰性組(P<0.05)(表2)。

CAG患者中Hp陽性17例，Hp陰性21例。Hp陽性組ZO-1蛋白陽性表達(dá)率顯著低于Hp陰性組(P<0.05)；兩組間occludin蛋白陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

四、不同炎癥活動度患者occludin、ZO-1蛋白表達(dá)情況

82例患者occludin、 ZO-1蛋白表達(dá)與胃黏膜炎癥活動度呈線性趨勢關(guān)系(P<0.05)，隨著炎癥活動度的增加，occludin、ZO-1蛋白表達(dá)顯著減弱(表3)。

五、Hp陽性轉(zhuǎn)陰后occludin、ZO-1蛋白表達(dá)比較

21例CNAG組Hp陽性患者均成功根除Hp，根除治療后occludin、ZO-1蛋白陽性表達(dá)率較根除治療前顯著升高(P<0.05)(表4)。

討 論

胃黏膜上皮慢性損傷和代償性修復(fù)過程可引起腺上皮細(xì)胞生理功能退化，導(dǎo)致黏膜變薄，間質(zhì)成分減少[2]。緊密連接、黏附連接、縫隙連接、橋粒等是胃黏膜上皮細(xì)胞間的主要連接方式，其結(jié)構(gòu)中包含多種細(xì)胞骨架成分，后者可保護(hù)胃壁或胃腺體細(xì)胞，避免其發(fā)生萎縮性變化。Occludin除作為細(xì)胞間緊密連接的重要組分，還能促進(jìn)胃腺體細(xì)胞間質(zhì)成分持續(xù)性增生，降低炎癥細(xì)胞對胃上皮基底膜的滲透，以及抑制胃腺體、間質(zhì)成分的代償性纖維化。ZO-1則通過形成細(xì)胞橋接蛋白成分，提高細(xì)胞間連接的緊密程度。

表1 CNAG、CAG患者occludin、ZO-1蛋白表達(dá)比較n(%)

*與正常對照組比較

表2 Hp陽性與陰性CNAG、CAG患者occludin、ZO-1蛋白表達(dá)比較n(%)

*Fisher精確檢驗(yàn)

表3 不同炎癥活動度患者occludin、ZO-1蛋白表達(dá)n(%)

表4 Hp陽性轉(zhuǎn)陰患者occludin、ZO-1蛋白表達(dá)變化n(%)

本研究發(fā)現(xiàn)，在CNAG、CAG患者的炎癥黏膜組織中， occludin、ZO-1表達(dá)顯著下降，提示兩者表達(dá)缺失可能參與了慢性胃炎的發(fā)生過程。Occludin、ZO-1低表達(dá)可能通過下述幾個(gè)方面發(fā)揮作用：occludin低表達(dá)降低細(xì)胞間的物理性連接力度，細(xì)胞間質(zhì)成分分解增加，促進(jìn)黏膜上皮萎縮；ZO-1表達(dá)下降可直接影響細(xì)胞間連接的數(shù)量，導(dǎo)致上皮細(xì)胞基底膜直接暴露于Hp、膽汁等刺激因素下。本研究結(jié)果顯示，在CNAG伴Hp感染患者的胃黏膜組織中，occludin、 ZO-1表達(dá)均明顯下降，顯著低于不伴Hp感染的患者。Hp感染對occludin、ZO-1的影響可能與其分泌的尿素酶、CagA、VacA等致病因子的破壞作用有關(guān)[3-4]。本組Hp陽性CAG患者的occludin無上述改變，考慮可能與樣本量偏小導(dǎo)致的偏倚有關(guān)，亦可能與免疫組化染色過程中的操作誤差有關(guān)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，隨著胃黏膜炎癥活動度的增加，occludin、ZO-1表達(dá)明顯減弱。炎癥反應(yīng)對兩者表達(dá)的影響，可能與單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等對黏膜屏障的損傷作用有關(guān)。Hp陽性轉(zhuǎn)陰后，CNAG患者occludin、ZO-1陽性表達(dá)率較根除治療前顯著升高，與國內(nèi)樊葉等[5]的研究發(fā)現(xiàn)相一致，進(jìn)一步證實(shí)occludin、ZO-1表達(dá)與Hp感染之間存在一定聯(lián)系，但具體機(jī)制尚未明確，有待探討。

綜上所述，本研究分析了occludin、ZO-1的表達(dá)與慢性胃炎伴Hp感染以及炎癥活動度的關(guān)系。Occludin、ZO-1在慢性胃炎組織中表達(dá)減弱，尤其是在CAG中表達(dá)降低更為明顯。此外，occludin、ZO-1表達(dá)與Hp感染以及胃炎活動度之間存在一定聯(lián)系。進(jìn)一步對相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行研究，有望為探索慢性胃炎的治療提供新方向。