Ki-67、p53、P504s在胃癌前病變和早期胃癌中的表達(dá)及其意義

余艷秋 王建寧 翟啟智 孫 琦 沈珊珊 鄒曉平*

南京醫(yī)科大學(xué)附屬江寧醫(yī)院消化科1(211100)南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院病理科2 消化科3

背景：胃癌的發(fā)生是多因素、多步驟、逐漸進(jìn)展的過程，發(fā)生細(xì)胞學(xué)和結(jié)構(gòu)異常的同時(shí)常存在某些分子表達(dá)的異常，涉及多種癌基因的活化和抑癌基因的失活。目的：探討Ki-67、p53、P504s在正常胃黏膜、萎縮性胃炎伴腸化生、低級別上皮內(nèi)瘤變、高級別上皮內(nèi)瘤變和早期胃癌中的表達(dá)及其意義。方法：收集2015年1月—2016年12月南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院44例正常胃黏膜、44例萎縮性胃炎伴腸化生黏膜、41例低級別上皮內(nèi)瘤變、38例高級別上皮內(nèi)瘤變和35例早期胃癌組織，以免疫組化法檢測Ki-67、p53、P504s表達(dá)。結(jié)果：Ki-67、p53、P504s在萎縮性胃炎伴腸化生、低級別上皮內(nèi)瘤變、高級別上皮內(nèi)瘤變、早期胃癌中的表達(dá)陽性率逐漸上升，且均顯著高于正常胃黏膜組織(P<0.05)。結(jié)論：Ki-67、p53、P504s表達(dá)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，參與了胃癌發(fā)生的早期過程，檢測上述三種分子標(biāo)記物有助于判斷病變的嚴(yán)重程度和進(jìn)展趨勢，有利于提高胃癌前病變和早期胃癌的檢出率。

胃癌的發(fā)生是一個(gè)漫長的過程，根據(jù)Correa學(xué)說[1]，腸型胃癌的發(fā)生是一個(gè)由正常黏膜-慢性炎癥-萎縮-腸化生-異型增生-癌變的逐漸進(jìn)展的多因素、多步驟過程。世界衛(wèi)生組織(WHO)為統(tǒng)一病理診斷標(biāo)準(zhǔn)，提出了“上皮內(nèi)瘤變”的概念，將其定義為一種具有惡性潛能的非浸潤性病變，可適用于所有浸潤性癌的前驅(qū)病變，具有潛在的分子學(xué)異常[2]。p53(突變型)和Ki-67(核蛋白抗體)表達(dá)與消化道腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、分化程度、浸潤深度、轉(zhuǎn)移、預(yù)后等環(huán)節(jié)密切相關(guān)。P504s又稱α-甲基酰酶輔酶A消旋酶(AMACR)，在支鏈脂肪酸和脂肪酸衍生物的β氧化以及膽酸代謝中間產(chǎn)物的氧化中發(fā)揮重要作用。P504s在腎癌、前列腺癌、結(jié)腸癌中高表達(dá)[3-5]，有研究[6]發(fā)現(xiàn)P504s在胃癌中的表達(dá)高于正常胃黏膜及其癌前病變組織，認(rèn)為其參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程。本研究通過應(yīng)用免疫組化染色檢測正常胃黏膜、癌前病變、早期胃癌中Ki-67、p53、P504s的表達(dá)，旨在探討三者在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的意義。

材料與方法

一、資料來源

收集2015年1月—2016年12月在南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院接受內(nèi)鏡下切除術(shù)的胃組織114例，其中男75例，女39例，平均年齡(61.6±4.4)歲；術(shù)后病理診斷為早期胃癌35例，低級別上皮內(nèi)瘤變41例，高級別上皮內(nèi)瘤變38例。選取同期胃鏡活檢病理為萎縮性胃炎伴腸化生44例，并取41例低級別上皮內(nèi)瘤變和3例高級別上皮內(nèi)瘤變旁正常胃黏膜組織作為對照組。

二、研究方法

所有標(biāo)本經(jīng)4%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋，厚2 μm連續(xù)切片。單克隆抗體Ki-67、P504s購自丹麥DAKO公司，突變型p53購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。Ki-67、P504s、p53工作濃度分別為1∶300、1∶200、1∶200。免疫組化染色采用Envision二步法，具體步驟按說明書進(jìn)行操作。以PBS代替一抗作為陰性對照，陽性對照為已知的陽性組織切片。

結(jié)果判斷：Ki-67和p53陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核，P504s陽性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，呈彌漫性顆粒狀陽性。計(jì)數(shù)Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，計(jì)算每100個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，取均值，陽性細(xì)胞數(shù)<10%為陰性(-)，10%～25%為弱陽性(+)，25%～75%為中等陽性(++)，>75%為強(qiáng)陽性(+++)。以染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)評估p53、P504s表達(dá)。染色強(qiáng)度：0分，細(xì)胞不著色(-)；1分，淡黃色(+)；2分，棕黃色(++)；3分，棕褐色(+++)。選取5個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，取均值。1分，0～25%；2分，25%～50%；3分，50%～75%；4分，75%～100%。染色強(qiáng)度評分與陽性細(xì)胞數(shù)評分之積作為染色評分，0～1分為陰性(-)，2～4分為弱陽性(+)，5～8分為中等陽性(++)，9～12分為強(qiáng)陽性(+++)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、Ki-67在不同階段胃黏膜中的表達(dá)

44例正常胃黏膜中Ki-67陽性表達(dá)僅9例，均為弱陽性。與正常胃黏膜組相比，萎縮性胃炎伴腸化生、低級別上皮內(nèi)瘤變、高級別上皮內(nèi)瘤變、早期胃癌組Ki-67表達(dá)陽性率顯著升高(P<0.05)。除早期胃癌組Ki-67表達(dá)陽性率與高級別上皮內(nèi)瘤變組無明顯差異外(P>0.05)，隨著病變程度的加重，Ki-67表達(dá)陽性率逐漸升高(P<0.05)。而早期胃癌組Ki-67強(qiáng)陽性率顯著高于高級別上皮內(nèi)瘤變組(P=0.011)(圖1、表1)。

二、p53在不同階段胃黏膜中的表達(dá)

44例正常胃黏膜中無p53陽性表達(dá)，隨著病變程度的加重，p53表達(dá)逐漸增加。與正常胃黏膜組相比，萎縮性胃炎伴腸化生組p53表達(dá)陽性率無明顯差異，低級別上皮內(nèi)瘤變、高級別上皮內(nèi)瘤變、早期胃癌組顯著增加(P<0.05)。從萎縮性胃炎伴腸化生-低級別上皮內(nèi)瘤變-高級別上皮內(nèi)瘤變，p53表達(dá)陽性率逐漸升高，組間相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。早期胃癌組p53表達(dá)陽性率、強(qiáng)陽性率與高級別上皮內(nèi)瘤變組相比均無明顯差異(P>0.05)(圖2、表2)。

三、P504s在不同階段胃黏膜中的表達(dá)

A：正常胃黏膜組織；B：萎縮性胃炎伴腸化生組織；C：低級別上皮內(nèi)瘤變組織；D：高級別上皮內(nèi)瘤變組織；E：早期胃癌組織

A：正常胃黏膜組織；B：萎縮性胃炎伴腸化生組織；C：低級別上皮內(nèi)瘤變組織；D：高級別上皮內(nèi)瘤變組織；E：早期胃癌組織

A：正常胃黏膜組織；B：萎縮性胃炎伴腸化生組織；C：低級別上皮內(nèi)瘤變組織；D：高級別上皮內(nèi)瘤變組織；E：早期胃癌組織

44例正常胃黏膜中P504s陽性表達(dá)7例，陽性表達(dá)率為15.9%。與正常胃黏膜組相比，萎縮性胃炎伴腸化生、低級別上皮內(nèi)瘤變、高級別上皮內(nèi)瘤變、早期胃癌組P504s表達(dá)陽性率均顯著增加(P<0.05)。除高級別上皮內(nèi)瘤變組與低級別上皮內(nèi)瘤變組P504s表達(dá)陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨著病變程度的加重，P504s表達(dá)陽性率無明顯差異(P>0.05)。早期胃癌組P504s表達(dá)強(qiáng)陽性率與高級別上皮內(nèi)瘤變組相比無明顯差異(P=0.103)(圖3、表3)。

討 論

胃黏膜癌變是一個(gè)復(fù)雜的過程，常需經(jīng)歷多年的癌前病變階段。2010年《消化系統(tǒng)腫瘤WHO分類》提出，在腫瘤轉(zhuǎn)化過程中細(xì)胞增殖和分化異?？沙霈F(xiàn)在形態(tài)學(xué)異常變化前，強(qiáng)調(diào)上皮內(nèi)瘤變通常是基于惡性轉(zhuǎn)化分子改變的細(xì)胞學(xué)和結(jié)構(gòu)異常，強(qiáng)調(diào)其腫瘤的性質(zhì)，而非絕對是腫瘤的形態(tài)[2]。在此基礎(chǔ)上，本研究按胃癌Correa級聯(lián)反應(yīng)過程收集了內(nèi)鏡活檢或內(nèi)鏡切除術(shù)后不同階段的胃黏膜組織，觀察在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中，發(fā)生細(xì)胞學(xué)和結(jié)構(gòu)異常的同時(shí)是否存在某些分子表達(dá)異常。

在胃癌發(fā)生、發(fā)展的過程中，常涉及多種癌基因的活化和抑癌基因的失活。Ki-67是重要的核增殖標(biāo)記基因，在正常組織中的分布可反映細(xì)胞的動(dòng)力特點(diǎn)。其在扁桃體的生發(fā)中心細(xì)胞、睪丸組織的未分化精原細(xì)胞、上皮基底層細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞中均有表達(dá)，與細(xì)胞增殖狀態(tài)相關(guān)，多用于判斷腫瘤的良惡性以及惡性程度、腫瘤分化程度、浸潤深度、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等情況。有研究[7]結(jié)果顯示Ki-67是評估惡性腫瘤治療療效和預(yù)后的重要分子標(biāo)記物。Wang等[8]發(fā)現(xiàn)在從胃黏膜腸化生、低級別上皮內(nèi)瘤變、高級別上皮內(nèi)瘤變至腸型胃癌逐漸進(jìn)展的過程中，Ki-67表達(dá)陽性率逐漸升高。但有研究[9-10]發(fā)現(xiàn)，Ki-67陽性表達(dá)與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，并不能作為判斷胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。p53是重要的抑癌基因，其突變是多種惡性腫瘤發(fā)生的重要原因之一。研究發(fā)現(xiàn)p53突變體可與野生型p53形成異二聚體，抑制野生型p53的抑癌功能[11]。有研究[12]發(fā)現(xiàn)突變型p53-R273H可抑制miR-27a的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而激活EGFR信號通路，使EGFR下游信號蛋白ERK1/2持續(xù)活化，促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤的發(fā)生。野生型p53基因產(chǎn)物半衰期短，而突變型p53基因產(chǎn)物較穩(wěn)定，故常規(guī)免疫組化法檢出的p53蛋白均為突變型。本研究結(jié)果顯示，隨著胃黏膜病變程度的加重，Ki-67和突變型p53陽性表達(dá)率均呈逐漸升高的趨勢。低級別上皮內(nèi)瘤變與萎縮性胃炎伴腸化生組、高級別上皮內(nèi)瘤變與低級別上皮內(nèi)瘤變組之間Ki-67和p53陽性表達(dá)率相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。雖然早期胃癌組與高級別上皮內(nèi)瘤變組之間Ki-67和p53表達(dá)陽性率無明顯差異，但表達(dá)強(qiáng)陽性率升高。推測Ki-67、p53在胃癌的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，對判斷病變的發(fā)展趨勢具有重要意義。

表1 Ki-67在不同階段胃黏膜組織中的表達(dá)

*與正常胃黏膜組織比較，P<0.05

表2 p53在不同階段胃黏膜組織中的表達(dá)

*與正常胃黏膜組織比較，P<0.05

表3 P504s在不同階段胃黏膜組織中的表達(dá)

*與正常胃黏膜組織比較，P<0.05

在胃癌和癌前病變組織中，幽門螺桿菌(Hp)感染與Ki-67和p53表達(dá)之間有一定的相關(guān)性。祁曉莉等[13]發(fā)現(xiàn)Hp感染的胃癌和癌前病變組Ki-67表達(dá)率明顯高于非Hp感染組，其機(jī)制可能是由于Hp感染可產(chǎn)生氧自由基和細(xì)胞因子，刺激胃黏膜上皮細(xì)胞增殖；或是由于Hp感染直接導(dǎo)致胃黏膜損傷，進(jìn)而引起胃黏膜上皮細(xì)胞代償性增生，最終可能通過誘發(fā)細(xì)胞增殖與凋亡的平衡失調(diào)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。國內(nèi)外研究[14-15]發(fā)現(xiàn)，Hp感染與p53過表達(dá)有關(guān)，可能是由于Hp感染使野生型p53轉(zhuǎn)變?yōu)橥蛔冃蚿53，導(dǎo)致p53喪失抑癌活性，從而促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。本實(shí)驗(yàn)未進(jìn)一步觀察Hp感染與Ki-67、p53表達(dá)的關(guān)系，后續(xù)將進(jìn)一步研究在胃黏膜癌變過程中Hp感染是否參與了細(xì)胞增殖分化的過程。

P504s在前列腺癌、骨髓、淋巴結(jié)、泌尿生殖系統(tǒng)和結(jié)腸腫瘤中均有表達(dá)。有研究[16]發(fā)現(xiàn)P504s蛋白在前列腺癌和前列腺高級別上皮內(nèi)腫瘤中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，而在前列腺增生組織中不表達(dá)。目前P504s在胃癌和癌前病變中表達(dá)的相關(guān)研究較少見。Lee[6]發(fā)現(xiàn)P504s在胃黏膜非腫瘤性上皮中呈弱表達(dá)，在異型增生和腸型胃癌中的表達(dá)明顯升高。多項(xiàng)研究[17-18]發(fā)現(xiàn)P504s在胃高度異型增生和腺癌中的陽性率高于低度異型增生和不確定性異型增生，說明P504s可作為判斷胃黏膜高度異型增生、低度異型增生以及不確定性異型增生的免疫標(biāo)記物。吳鳳婷等[19]發(fā)現(xiàn)P504s表達(dá)和分布與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可作為診斷胃癌的新候選分子標(biāo)記物，胃鏡下組織病理活檢聯(lián)合P504s檢測可有效提高早期胃癌的檢出率。陸勤平等[20]的研究結(jié)果顯示P504s表達(dá)與胃癌Lauren分型和分化程度密切相關(guān)，可能參與了胃腸型腺癌的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示從正常胃黏膜-萎縮性胃炎伴腸化生-低級別上皮內(nèi)瘤變-高級別上皮內(nèi)瘤變-早期胃癌的發(fā)展過程中，P504s陽性表達(dá)率逐漸上升，其中高級別上皮內(nèi)瘤變與低級別上皮內(nèi)瘤變組的陽性表達(dá)率相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而早期胃癌組與高級別上皮內(nèi)瘤變組相比無明顯差異(P>0.05)，但表達(dá)強(qiáng)陽性率顯著高于高級別上皮內(nèi)瘤變組。與黃文斌等[18]的研究結(jié)果基本一致。李媛[21]認(rèn)為聯(lián)合p53過表達(dá)、表面上皮和小凹Ki-67增殖指數(shù)增高和P504s高表達(dá)有助于胃黏膜上皮異型增生的診斷。

總之，本研究結(jié)果表明Ki-67、p53、P504s在胃黏膜中的陽性表達(dá)率隨著病變嚴(yán)重程度的增加而逐漸升高，強(qiáng)陽性率亦逐漸增高，提示上述三個(gè)指標(biāo)可能參與了胃癌發(fā)生的早期過程，且與病變進(jìn)展相關(guān)，監(jiān)測其表達(dá)可用于對胃黏膜癌前病變的監(jiān)測。對于表達(dá)陽性的萎縮性胃炎伴腸化生、低級別上皮內(nèi)瘤變患者需密切隨訪觀察，對于表達(dá)陽性的高級別上皮內(nèi)瘤變患者需積極給予治療。同時(shí)對僅靠細(xì)胞形態(tài)學(xué)無法準(zhǔn)確判斷是否存在胃黏膜上皮內(nèi)瘤變或無法準(zhǔn)確進(jìn)行上皮內(nèi)瘤變病理分級的病例，可提供輔助診斷依據(jù)。P504s在胃癌和癌前病變中的研究較少，本研究推測P504s可作為胃癌前病變和早期胃癌的新分子標(biāo)記物，對鑒別低級別上皮內(nèi)瘤變和高級別上皮內(nèi)瘤變有一定的參考意義。綜上所述，聯(lián)合檢測Ki-67、p53、P504s表達(dá)可能有助于判斷胃癌前病變的嚴(yán)重程度以及預(yù)測病變的發(fā)展趨勢，有利于提高胃癌前病變和早期胃癌的檢出率。