基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究蒙藥棘豆止咳散主治“痰、咳、喘”作用機制

蘇都那布其，吳鳳嬌，楊立國，王秀蘭*

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2.內(nèi)蒙古蒙醫(yī)藥 工程技術(shù)研究院，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

蒙醫(yī)藥是蒙古族在長期的生產(chǎn)實踐中同疾病抗?fàn)幍慕?jīng)驗積累和總結(jié)，是我國民族醫(yī)藥之一；其以三根學(xué)說、七素學(xué)說、寒熱理論、臟腑理論、六基病癥理論為基礎(chǔ)，形成獨特理論體系[1]。蒙藥具有多成分、多靶點、調(diào)節(jié)方式多樣的特點，蘊含著極大的信息量，因此對治療復(fù)雜疾病上具有明顯的特色和優(yōu)勢。棘豆止咳散為內(nèi)蒙古通遼市庫倫旗蒙醫(yī)醫(yī)院醫(yī)院制劑[2]，由甘草、川貝母、多葉棘豆和石膏等4味藥組成，用于調(diào)節(jié)三根平衡，清除希拉熱邪，從而達(dá)到清熱、潤肺、化痰、止咳和平喘作用。現(xiàn)代研究表明多葉棘豆主要活性成分為黃酮類成分[3]，甘草主要活性成分為三萜皂苷類成分[4]和黃酮苷類成分[5]，具有鎮(zhèn)咳、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[6]；川貝母主要活性成分為甾體生物堿[7]，石膏主含含水硫酸鈣[8]。查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)棘豆止咳散為民間經(jīng)驗積累，少數(shù)研究集中在質(zhì)量控制[9-11]上，缺少科學(xué)藥效實驗研究。故本研究先運用動物實驗觀察棘豆止咳散對小鼠的止咳、化痰和平喘作用，后基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，以棘豆止咳散主要活性成分為研究對象，通過建立“棘豆止咳散活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)，闡述其止咳、化痰和平喘作用機制。

1 棘豆止咳散止咳、化痰和平喘藥效學(xué)研究

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與藥物 SPF級昆明級小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，雌雄各半(購自遼寧長生生物有限公司，動物許可證號：SCXK(遼)-2015-0001)；棘豆止咳散(高、中、低)由庫倫旗蒙醫(yī)醫(yī)院提供；肺寧顆粒(批號：190160016；吉林華康藥業(yè)股份有限公司)；氨茶堿片(批號：190218；山西太原藥業(yè)有限公司)。

1.1.2 實驗儀器與試劑 TG16-WS離心機(上海安亭科學(xué)儀器)；UV-1500PC紫外可見分光光度計(上海四科儀器設(shè)備有限公司)；AUY120EXP電子分析天平(日本島津)；YLS-8A多功能誘咳引喘氣儀(江蘇賽昂斯生物科技有限公司)；HH-W600恒溫水浴鍋(常州金南儀器制造有限公司)；酚紅(天津大茂化學(xué)試劑廠，批號：20180915)；氨水(天津大茂化學(xué)試劑廠，批號：20190103)；生理鹽水(吉林省都邦藥業(yè)股份有限公司，批號：H19031812)；磷酸組胺(批號：527A021，美谷生物科技(浙江)有限公司Solarbio品牌；純度≥98.0%)。

1.2 方法

1.2.1 濃氨水致小鼠咳嗽實驗[12-14]取SPF級昆明級小鼠50只，體質(zhì)量(20±2)g，雌雄各半，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后按體質(zhì)量隨機分為正常組(給予等量蒸餾水)，棘豆止咳散低、中、高給藥組(1.17 g/kg、2.34 g/kg、3.51 g/kg)，陽性對照組為肺寧顆粒(0.072 g/kg)，共5組。各組小鼠分別灌胃給予藥物，給藥體積為0.2 mL/10 g，每日1次，連續(xù)給藥7天。末次給藥前禁食不禁水12小時后給藥，給藥1 h后，將小鼠置于YLS-8A多功能誘咳引喘氣儀中，氨水噴7 s后按小鼠出現(xiàn)腹肌收縮、縮胸、張大嘴，咳聲有無，作為咳嗽反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，觀察并記錄小鼠從接受噴霧開始到出現(xiàn)咳嗽的時間(咳嗽潛伏期)3 min內(nèi)咳嗽反應(yīng)總次數(shù)。

1.2.2 小鼠氣管段酚紅排泌實驗(祛痰實驗)[12-14]按“1.2.1”方法取SPF級昆明級小鼠50只，給藥1 h后，每只小鼠腹腔注射0.5%酚紅溶液0.5 mL，30 min后脫頸椎處死。動物仰臥固定，解剖分離出氣管。于喉頭下將磨平頭的7號針頭插入氣管內(nèi)約0.3 cm，絲線結(jié)扎固定，用1 mL注射器吸取0.5 mL 5%碳酸氫鈉溶液，反復(fù)灌洗呼吸道3次，并將灌洗液回收集中注入干凈試管中。按上述方法操作3次，合并3次的洗液，置離心機中離心20 min(12 000 r/min)，取上清液于比色管中，用分光光度計測定 546 nm 處吸光度(A)值，以A值高低代表呼吸道酚紅排泌量。

1.2.3 磷酸組胺誘發(fā)小鼠哮喘實驗(平喘實驗)[12-14]按“1.2.1”方法取SPF級昆明級小鼠50，陽性對照組為氨茶堿片(0.082 g/kg)，將小鼠置于YLS-8A多功能誘咳引喘氣儀中，噴予5%磷酸組胺溶液30 s，后記錄觀察小鼠6 min內(nèi)引喘的潛伏期，即從噴入藥液到小鼠第一次抽搐的時間。

1.3 結(jié)果

1.3.1 棘豆止咳散對濃氨水致小鼠咳嗽實驗的影響 與對照組比較，棘豆止咳散高劑量組咳嗽次數(shù)顯著減少(P<0.05)；棘豆止咳散中劑量組與高劑量組咳嗽潛伏期顯著延長(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 棘豆止咳散對濃氨水致小鼠咳嗽實驗的影響

1.3.2 棘豆止咳散對小鼠氣管段酚紅排泌實驗(祛痰實驗)的影響 與對照組比較棘豆止咳散高劑量組吸光度(A)值明顯增加(P<0.05)。見表2。

表2 棘豆止咳散對小鼠氣管段酚紅排泌實驗(祛痰實驗)的影響

1.3.3 棘豆止咳散對磷酸組胺誘發(fā)小鼠哮喘實驗(平喘實驗)的影響 與對照組比較棘豆止咳散中劑量組引喘潛伏期(S)值明顯增加(P<0.05)，高劑量組引喘潛伏期(S)值明顯增加(P<0.01)。見表3。

表3 棘豆止咳散對磷酸組胺誘發(fā)小鼠哮喘實驗(平喘實驗)的影響

2 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究蒙藥棘豆止咳散止咳、化痰和平喘作用機制

2.1 方法

2.1.1 棘豆止咳散化學(xué)成分收集與活性成分篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫對甘草、川貝母化合物進行收集，根據(jù)ADME：OB≥30%，DL≥0.18進行篩選，再以活性成分相關(guān)文獻(xiàn)予以補充；TCMID數(shù)據(jù)庫收集石膏相關(guān)信息；多葉棘豆化學(xué)成分查詢相關(guān)文獻(xiàn)收集，再以ADME參數(shù)篩選。

2.1.2 活性成分靶點預(yù)測 TCMSP數(shù)據(jù)庫收集活性成分相關(guān)靶點，TCMSP數(shù)據(jù)庫未收集到的活性成分能相關(guān)靶點的再利用Pubchem數(shù)據(jù)庫，收集活性成分Canonical SMILES格式，將 SMILES格式文件導(dǎo)入到Swiss Target Predicton數(shù)據(jù)庫，設(shè)置屬性為“Homo Sapiens”，預(yù)測相關(guān)靶點，去掉Probability值為0的所有靶點；STITCH數(shù)據(jù)庫收集石膏相關(guān)靶點；靶點進行除重。

2.1.3 棘豆止咳散止咳、化痰和平喘作用靶點的收集 將活性成分預(yù)測靶點信息與DisGeNET數(shù)據(jù)庫以“Coughing”和“Asthma”為關(guān)鍵詞收集止咳平喘相關(guān)靶點信息，DrugBank數(shù)據(jù)庫以“Phlegm”為關(guān)鍵詞收集化痰相關(guān)靶點信息進行比對，作韋恩圖進行交集分析，收集棘豆止咳散止咳、化痰和平喘作用靶點。

2.1.4 關(guān)鍵靶點蛋白相關(guān)作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將棘豆止咳散止咳、化痰和平喘作用靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，選擇物種為“Homo Sapiens”進行計算，設(shè)定評分分值>0.4，獲得蛋白互作關(guān)系，保存為tsv格式文件。運用R語言抽取網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點的信息條形圖篩選出核心靶點。

2.1.5 GO富集分析和KEGG通路注釋分析 為了研究化合物可能作用的生物學(xué)通路以及靶點之間的相關(guān)關(guān)系，揭示靶點蛋白的相互作用關(guān)系以及在基因功能上的富集情況，將篩選的棘豆止咳散止咳、化痰和平喘作用靶點導(dǎo)入生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫(DAVID)進行GO富集分析和基因與基因組百科全書(KEGG)代謝通路注釋分析，選擇物種為(Human)，得到P<0.05的GO功能富集和KEGG通路。

2.1.6 “活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將棘豆止咳散活性成分、潛在靶點、通路數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，通過Merge工具構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)。

2.2 結(jié)果

2.2.1 棘豆止咳散活性成分 過TCMSP數(shù)據(jù)庫對甘草、川貝母化合物進行收集，根據(jù)ADME：OB≥30%，DL≥0.18進行篩選，在以活性成分相關(guān)文獻(xiàn)予以補充；TCMID數(shù)據(jù)庫收集石膏相關(guān)信息；多葉棘豆化學(xué)成分查詢相關(guān)文獻(xiàn)收集，在以ADME參數(shù)篩選后得111個活性成分。棘豆止咳散各單味藥活性成分及相關(guān)信息見表4。

續(xù)表4

續(xù)表4

2.2.2 潛在靶點 基于TCMSP和Swiss Target Predicton數(shù)據(jù)庫得到1 235個基因靶點，刪除重復(fù)項后得到472個基因靶點。通過與DisGeNET和DrugBank疾病數(shù)據(jù)庫中止咳、化痰和平喘相關(guān)靶點進行比對，最終篩選出46個潛在靶點。見圖1與表5。

圖1 棘豆止咳散止咳、化痰和平喘作用靶點韋恩圖

表5 棘豆止咳散止咳、化痰和平喘作用靶點信息

續(xù)表5

2.2.3 蛋白互作(PPI)與核心靶點 登錄STRING數(shù)據(jù)庫，上傳棘豆止咳散止咳、化痰和平喘潛在靶點，設(shè)定置信度評分分值>0.4，將獨立于網(wǎng)絡(luò)之處的蛋白排除，得到棘豆止咳散止咳、化痰和平喘潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖(見圖2)。運用R語言抽取網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點的信息條形圖(見圖3)。結(jié)果表明，IL6、PTGS2、TNF、VEGFA等蛋白的度值較高，說明這些蛋白在網(wǎng)絡(luò)中的作用顯著，是和其他蛋白互通的紐帶。

圖2 關(guān)鍵靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 關(guān)鍵靶點信息

2.2.4 GO功能富集分析 GO注釋分析由生物過程(Biological process，BP)、細(xì)胞組成(Cellular component，CC)、分子功能(Molecular function，MF)3個部分組成，共同描述基因生物學(xué)功能。將棘豆止咳散止咳、化痰和平喘作用靶點上傳到DAVID平臺，根據(jù)PValue<0.05為篩選條件，共收集到530條BP條目主要涉及激素刺激反應(yīng)(Response to hormone stimulus)、對有機物的反應(yīng)(Response to organic substance)、對內(nèi)生刺激的反應(yīng)(Response to endogenous stimulus)、細(xì)胞凋亡的調(diào)控(Regulation of apoptosis)等；32條CC條目主要涉及細(xì)胞外間隙(Extracellular space)、細(xì)胞外區(qū)(Extracellular region part)、神經(jīng)元投射(Neuron projection)、細(xì)胞分?jǐn)?shù)(Cell fraction)等；25條MF條目主要涉及細(xì)胞因子活性(Cytokine activity)、同一蛋白結(jié)合(Identical protein binding)、蛋白質(zhì)二聚活性(Protein dimerization activity)、蛋白質(zhì)均聚活性(Protein homodimerization activity)等，根據(jù)PValue值，用條形圖分別列舉了各類被排在靠前的10個條目。見圖4。

2.2.5 KEGG通路富集分析 將棘豆止咳散止咳、化痰和平喘作用靶點上傳到DAVID平臺進行富集分析，根據(jù)PValue<0.05為篩選條件，共獲得16條KEGG信號通路。信號通路包括細(xì)胞因子-細(xì)胞因子-受體相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)、癌癥的途徑(Pathways in cancer)、鈣信號通路(Calcium signaling pathway)、哮喘(Asthma)、腸免疫網(wǎng)絡(luò)用于IgA的產(chǎn)生(Intestinal immune network for IgA production)等。見圖5。

注：A.生物過程(BP)；B.細(xì)胞組成(CC)；C.分子功能(MF)。圖4 GO功能富集分析

圖5 KEGG通路富集分析

2.2.6 棘豆止咳散化合物-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將棘豆止咳散活性成分、作用靶點、KEGG通路信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，見圖6。按Degree值和BC值大小排序篩選核心成分和靶點，結(jié)果顯示，quercetin、luteolin、apigenin、kaempferol等為核心成分，PTGS2、NOS2、ADRB2、TNF等靶點為核心靶點，從而可以看出棘豆止咳散多成分-多靶點-多通路的作用特點。

3 討論

石膏主含含水硫酸鈣(CaSO4·2H2O)，具有清熱瀉火、除煩止渴之功效，用于外感熱病，高熱煩渴，肺熱喘咳，胃火亢盛，頭痛，牙痛[8]。文獻(xiàn)[15]對 2005 版《中國藥典》所含石膏制劑進行統(tǒng)計，總計有29個中成藥含有石膏，以治療感冒、咳嗽藥為主。其中所含石膏在處方中所占比例一般在3%～45%之間，個別高達(dá)90%，由此肯定棘豆止咳散中石膏具有一定的止咳、化痰和平喘作用。但含水硫酸鈣記錄靶點少，從而本次研究中未能體現(xiàn)石膏的止咳、化痰和平喘作用。

棘豆止咳散為內(nèi)蒙古通遼市庫倫旗蒙醫(yī)醫(yī)院醫(yī)院制劑，由殺“黏”、清熱、燥“協(xié)日烏素”的蒙古族習(xí)用藥材多葉棘豆為主藥，處方比例為多葉棘豆30 g 、川貝母15 g 、甘草30 g 、石膏15 g，用于“巴達(dá)干”“赫依”引起的咳嗽、感冒。本研究采用經(jīng)典的濃氨水致小鼠咳嗽實驗、小鼠氣管段酚紅排泌實驗(祛痰實驗)、磷酸組胺誘發(fā)小鼠哮喘實驗(平喘實驗)等藥理實驗方法研究棘豆止咳散的止咳、祛痰和平喘藥效學(xué)作用，并選擇臨床止咳祛痰常用藥肺寧顆粒與用于支氣管哮喘常用藥氨茶堿片為陽性對照組，結(jié)果棘豆止咳散止咳、祛痰和平喘作用顯著，且化痰作用比陽性對照組顯著。

注：四邊節(jié)點代表蒙藥，六邊形節(jié)點代表活性成分，圓形節(jié)點代表作用靶點，長方形節(jié)點代表作用通路。圖6 棘豆止咳散“蒙藥-活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)

本研究在棘豆止咳散止咳、祛痰和平喘藥效學(xué)作用上，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法共篩選出111個活性成分(甘草92個、川貝母15個、多葉棘豆8個、石膏1個)，潛在作用靶點472個，46個與止咳、祛痰和平喘重合靶點。根據(jù)“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖按Degree值和BC值大小排序前5位化合物為槲皮素、木犀草素、山奈酚、芹菜素、柚皮素。據(jù)報道槲皮素具有抗炎、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[16]，木犀草素具有消炎、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等作用，臨床主要用于止咳、祛痰和消炎[17-18]，山柰酚具有抗炎、抗菌、抗病毒、增強機體免疫等多種藥理作用[19]，芹菜素具有抗腫瘤、心血管保護、抗病毒、抗菌等藥理作用[20-22]，柚皮素具有一定增強細(xì)胞免疫、抗炎的藥理作用[23]，綜上棘豆止咳散關(guān)鍵前5種化合物具有抗炎、抗病毒、抗菌、止咳、祛痰和免疫調(diào)節(jié)能力，故而進一步確定了棘豆止咳散止咳、祛痰和平喘藥效學(xué)作用，也說明了蒙藥棘豆止咳散多成分、多靶點、多途徑的特點。