何俊金 王建萍 丁雪梅 曾秋鳳 白世平 張克英
(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所,動物抗病營養(yǎng)教育部重點(diǎn)實驗室,動物抗病營養(yǎng)與飼料農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)實驗室,成都 611130)
我國是世界上最大的雞蛋生產(chǎn)和消費(fèi)國,雞蛋產(chǎn)量約占全世界總產(chǎn)量的45%,且呈逐年上升的趨勢。目前高產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋后期45周齡時產(chǎn)蛋率降到88%左右,而后產(chǎn)蛋率下降速度逐漸增快,80周齡時下降到60%左右。同時,長期高產(chǎn)蛋積累的應(yīng)激導(dǎo)致雞蛋品質(zhì)下降,包括蛋殼質(zhì)量和蛋清品質(zhì),因而如何提高雞蛋品質(zhì)特別是產(chǎn)蛋后期的雞蛋品質(zhì)至關(guān)重要。前人研究報道也證實氧化應(yīng)激造成的繁殖性能衰退可能是蛋雞產(chǎn)蛋后期和應(yīng)激時產(chǎn)蛋性能下降的主要原因[1]。
茶多酚(tea polyphenols,TP)是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱,主要為兒茶素類(占60%~80%),是茶葉中有保健功能的主要成分之一。茶多酚具有較強(qiáng)的抗氧化能力,研究表明其抗氧化能力是維生素C的25倍,是維生素E的80倍[2-3]。茶多酚具有抑菌、抗病、改善腸道微生物環(huán)境和降血脂等作用,可保障動物機(jī)體健康,但對蛋雞生產(chǎn)性能的影響并不一致[4]。同時,有研究報道,茶多酚能夠一定程度上改善雞蛋品質(zhì),降低雞蛋中的膽固醇含量[4]。樓洪興等[5]等研究發(fā)現(xiàn),在蛋雞飼糧中添加250、550和1 000 mg/kg茶多酚(純度為40%)對蛋雞產(chǎn)蛋率有一定的改善作用,但隨著茶多酚的添加水平的提高未見有增高趨勢,添加400 mg/kg茶多酚降低46周齡蛋雞血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白含量并提高高密度脂蛋白含量;張旭等[6]在蛋雞飼糧中添加100 mg/kg茶多酚(純度為98%)能夠顯著提高平均蛋重,顯著降低料蛋比和蛋黃膽固醇含量;Biswas等[7]發(fā)現(xiàn),飼糧添加300 mg/kg的綠茶粉使蛋雞采食量顯著下降,平均蛋重顯著降低。由此可見,茶多酚對蛋雞生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)影響的報道并不一致,這可能與茶多酚添加物的純度和添加劑量不同有關(guān)。目前茶多酚對蛋雞脂質(zhì)代謝影響的研究較少,有待進(jìn)一步的揭示。因此,本試驗通過考察高劑量茶多酚對產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)和脂質(zhì)代謝的影響,探討提高產(chǎn)蛋后期蛋雞產(chǎn)蛋性能和蛋品質(zhì)的營養(yǎng)手段。
試驗所用茶多酚產(chǎn)品由四川克魯尼茶葉生物科技有限公司提供,其純度為63.58%,其中兒茶素含量為40.20%,表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)含量為21.97%,咖啡堿含量為6.84%。
試驗選用65周齡的健康羅曼粉殼蛋雞480羽,采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計,將蛋雞分為4組,每組8個重復(fù),每個重復(fù)15羽。預(yù)試期2周,正試期9周。
試驗用基礎(chǔ)飼糧為玉米-豆粕型飼糧,在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所試驗基地參照我國《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)中蛋雞營養(yǎng)成分推薦值配制?;A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。
表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))
1)維生素預(yù)混料為每千克飼糧提供 Vitamin premix provided the following per kilogram of the diet:VA 8 000 IU,VD31 600 IU,VE 5 IU,VB10.8 mg,VB22.5 mg,VB61.5 mg,VB120.004 mg,D-泛酸D-pantothenic acid 2.2 mg,葉酸 folic acid 0.25 mg,煙酸 nicotinic acid 20 mg,生物素 biotin 0.1 mg。2)礦物質(zhì)預(yù)混料為每千克飼糧提供 Mineral premix provided the following per kilogram of the diet:Mn(MnO2) 60 mg,Zn(ZnSO4·7H2O) 80 mg,Cu(CuSO4·5H2O) 8 mg,F(xiàn)e(FeSO4·7H2O) 60 mg,I(KI) 0.35 mg,Se(Na2SeO3·5H2O) 0.3 mg。3)代謝能為計算值,其他為測定值。ME was a calculated value, while the others were measured values.
將4組蛋雞隨機(jī)分為1個對照組和3個試驗組,對照組蛋雞飼喂基礎(chǔ)飼糧,試驗組蛋雞分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加666、1 333和2 666 mg/kg茶多酚的試驗飼糧。
飼養(yǎng)試驗在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)所試驗場進(jìn)行。所有試驗蛋雞均采用3層階梯式籠養(yǎng),每籠3只雞,連續(xù)的5籠為1個重復(fù),每組8個重復(fù)。全程采用粉料飼養(yǎng),光照16 h,舍內(nèi)溫度控制在22 ℃左右,自由飲水,每天喂食2次(09:00和15:00),并觀察雞只有無異常行為,每天16:00揀蛋并記錄稱重。定期打掃圈舍衛(wèi)生,并按常規(guī)程序進(jìn)行雞只免疫和圈舍消毒。
1.4.1 生產(chǎn)性能指標(biāo)的測定
產(chǎn)蛋率、平均蛋重:正試期內(nèi)每日以重復(fù)為單位記錄產(chǎn)蛋數(shù)和產(chǎn)蛋重,計算產(chǎn)蛋率和平均蛋重。
平均日采食量:每天記錄飼糧的添給與損耗情況,每周結(jié)算飼糧總采食量,計算平均日采食量。
料蛋比:根據(jù)產(chǎn)蛋總重和總采食量計算料蛋比。
1.4.2 蛋品質(zhì)指標(biāo)的測定
在試驗第9周結(jié)束時每個重復(fù)采集2枚外形完好、重量接近平均蛋重的雞蛋(16:00采集,19:00測定蛋品質(zhì)),采用蛋品質(zhì)全自動測定儀(EMT-7300,日本)對蛋殼強(qiáng)度、蛋黃顏色和哈夫單位進(jìn)行測定。小心移除蛋清后,對蛋黃重和蛋殼重進(jìn)行稱量,計算蛋殼比率、蛋黃比率和蛋白比率。
蛋殼比率(%)=100×蛋殼重/蛋重; 蛋黃比率(%)=100×蛋黃重/蛋重; 蛋白比率(%)=100×(蛋重-蛋黃重-蛋殼重)/蛋重。
蛋黃膽固醇含量:使用高效液相色譜法測定蛋黃膽固醇含量,具體方法參照GB/T 22220—2008。
蛋黃脂肪酸組成:使用氣相色譜法測定蛋黃脂肪酸組成,具體方法參照NY/T 2068—2011。
1.4.3 血清脂質(zhì)代謝指標(biāo)的測定
在試驗第9周結(jié)束時,每個重復(fù)隨機(jī)挑選1只健康的蛋雞,從翅靜脈抽取10 mL血液,分離血清,-20 ℃保存,采用全自動生化分析儀(HITACHI7020,日本)測定血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量。
1.4.4 肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量的測定
將采集血液后的蛋雞頸靜脈放血屠宰,分離肝臟左葉尖端1.5 g左右,裝于2 mL滅菌EP管中,立即保存于液氮中,然后置于-80 ℃冰箱保存,用于測定肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA的相對表達(dá)量。
根據(jù)NCBI公布的脂肪酸合成酶(FAS)、低密度脂蛋白受體(LDLR)、極低密度脂蛋白受體(VLDLR)、腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)和β-肌動蛋白(β-actin)的基因序列來設(shè)計引物并檢測引物的特異性,以β-actin作為內(nèi)參基因。引物由Invitrogen公司合成,目的基因和內(nèi)參基因的引物序列見表2。
肝臟組織中RNA的提取采用兩步法按說明書操作。使用SYBR?Premix Ex TaqTMKit(TaKaRa生物有限公司,日本)試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR測定。采用Applied Biosystems 7900HT Real Time PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems,CA)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),程序如下:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,40個循環(huán);熔解曲線條件:95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s。參考Livak等[8]的方法,以β-actin為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA的相對表達(dá)量,以相對于對照組的變化倍數(shù)表示。
試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),并采用Duncan氏法進(jìn)行組間多重比較,P≤0.05表示差異顯著。
由表3可知,與對照組相比,2 666 mg/kg茶多酚組第1~3周、第4~6周和第1~9周產(chǎn)蛋率均顯著下降(P<0.05)。與對照組相比,各茶多酚添加組的平均日采食量呈不同程度的降低,但隨著試驗進(jìn)行,各茶多酚添加組的平均日采食量逐漸上升,與對照組的差距逐漸縮小,2 666 mg/kg茶多酚組的平均日采食量在第1~3周、第4~6周、第7~9周和第1~9周均顯著低于對照組(P<0.05),1 333 mg/kg茶多酚組的平均日采食量在第1~3周和第4~6周顯著低于對照組(P<0.05)且顯著高于2 666 mg/kg茶多酚組(P<0.05),666 mg/kg茶多酚組的平均日采食量在第1~3周顯著低于對照組(P<0.05)且顯著高于2 666 mg/kg茶多酚組(P<0.05)。2 666 mg/kg茶多酚組的平均蛋重在第1~3周和第1~9周顯著低于對照組與666 mg/kg茶多酚組(P<0.05),1 333和2666 mg/kg茶多酚組的平均蛋重在第4~6周顯著低于對照組(P<0.05)。2 666 mg/kg茶多酚組的料蛋比在第1~3周和第4~6顯著高于其他各組(P<0.05)。
表2 引物序列
表3 飼糧中添加高劑量茶多酚對蛋雞生產(chǎn)性能的影響
同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P≤0.05),無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P≤0.05), while with the same letter or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.
由表4可知,與對照組相比,飼糧中添加不同劑量的茶多酚對蛋殼強(qiáng)度、蛋黃顏色、蛋黃比率和蛋白比率均無顯著影響(P>0.05)。2 666 mg/kg茶多酚組哈夫單位在第2周顯著高于對照組(P<0.05),1 333 mg/kg茶多酚組哈夫單位在第4周顯著高于其他各組(P<0.05)。2 666 mg/kg茶多酚組蛋殼比率在第2周顯著低于對照組與1 333 mg/kg茶多酚組(P<0.05),且1 333 mg/kg茶多酚組蛋殼比率在第2周也顯著低于對照組(P<0.05)。
表4 飼糧中添加高劑量茶多酚對蛋雞蛋品質(zhì)的影響
由表5可知,與對照組相比,飼糧中添加不同劑量的茶多酚顯著影響蛋黃膽固醇含量(P<0.05),且隨著茶多酚添加劑量的增加,蛋黃膽固醇含量有降低趨勢。666、1 333和2666 mg/kg茶多酚組蛋黃膽固醇含量顯著低于對照組(P<0.05),且2 666 mg/kg茶多酚組蛋黃膽固醇含量還顯著低于666 mg/kg茶多酚組(P<0.05)。飼糧中添加不同劑量的茶多酚對蛋黃脂肪酸組成無顯著影響(P>0.05)。
表5 飼糧中添加高劑量茶多酚對蛋雞蛋黃膽固醇含量和脂肪酸組成的影響
由表6可知,與對照組相比,飼糧中添加不同劑量的茶多酚對蛋雞血清高密度脂蛋白膽固醇含量無顯著影響(P>0.05)。與對照組相比,666、1 333和2 666 mg/kg茶多酚組血清總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇含量顯著降低(P<0.05),1 333和2 666 mg/kg茶多酚組血清甘油三酯含量顯著降低(P<0.05)。
表6 飼糧中添加高劑量茶多酚對蛋雞血清脂質(zhì)代謝指標(biāo)的影響
由圖1可知,666、1 333和2 666 mg/kg茶多酚組肝臟AMPKmRNA相對表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05),且2 666 mg/kg茶多酚組肝臟AMPKmRNA相對表達(dá)量還顯著高于666和1 333 mg/kg茶多酚組(P<0.05)。肝臟脂質(zhì)代謝其他相關(guān)基因(FAS、LDLR和VLDR)mRNA的相對表達(dá)量各組間均差異不顯著(P>0.05)。
通過對蛋雞進(jìn)行9周的茶多酚飼喂試驗,結(jié)果表明,飼糧添加666 mg/kg茶多酚對蛋雞產(chǎn)蛋率沒有顯著影響,而添加2 666 mg/kg茶多酚后蛋雞的產(chǎn)蛋率顯著下降。這可能與本試驗發(fā)現(xiàn)的添加茶多酚以后降低了蛋雞的采食量有關(guān)。這與前人研究結(jié)果并不相同,樓洪興等[5]在飼糧中添加250、550和666 mg/kg茶多酚(純度為40%)后發(fā)現(xiàn)對蛋雞的產(chǎn)蛋率有一定改善作用,但隨著茶多酚的添加劑量的提高未見有增高趨勢。樓洪興等[5]的試驗結(jié)果與本試驗結(jié)果不同的原因可能是茶多酚的來源和添加劑量的不同,本試驗添加的茶多酚產(chǎn)品中含有一部分咖啡堿(6.84%),而咖啡堿可能與蛋雞采食量的降低有關(guān),且本試驗中茶多酚的添加劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于樓洪興等[5]的試驗。
數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P≤0.05),不標(biāo)注字母或標(biāo)注相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。
本試驗中,飼糧中添加不同劑量的茶多酚均可降低蛋雞的平均蛋重,這與相關(guān)報道相近,例如,飼糧中添加0.67%茶葉提取物略微降低平均蛋重[9],飼糧中添加5%和10%綠茶粉顯著降低蛋重[10]。除采食量降低是影響蛋重的原因外,兒茶素抑制了腸道對脂肪的吸收和脂肪酶活性,使蛋黃脂質(zhì)形成受阻[9-10],也會影響蛋重。
本試驗中,各茶多酚添加組料蛋比均高于對照組,與前人研究結(jié)果不相同。王人悅[11]試驗表明茶多酚顯著降低料蛋比;汪小紅等[12]研究發(fā)現(xiàn),400 mg/kg茶多酚顯著降低了試驗期前4周的平均蛋重,200 mg/kg茶多酚顯著降低了試驗期后4周的料蛋比。上述研究結(jié)果與本試驗結(jié)果不同的原因可能是茶多酚的來源和添加劑量的不同。
飼糧中添加不同劑量的茶多酚后蛋雞平均日采食量均下降,產(chǎn)蛋率和平均蛋重下降及料蛋比的升高均與采食量下降有極大關(guān)系。據(jù)尹靖東等[13]報道,飼喂蛋雞綠茶粉時,隨著綠茶粉添加劑量的增加,蛋雞的采食量也增加,這與本試驗結(jié)果不相同。Biswas等[7]報道,飼糧中添加0.3%的綠茶粉(飼糧中茶多酚含量約為600 mg/kg)可使蛋雞的采食量顯著下降,本試驗結(jié)果與之相似。造成結(jié)果不同的原因可能有:蛋雞對茶多酚本身或咖啡堿的苦澀味并不適應(yīng),蛋雞對茶多酚有一個逐漸的適應(yīng)過程,在試驗初期蛋雞采食量急劇下降,之后逐漸增加;另外,茶多酚中含有的酚酸、咖啡堿及縮合單寧等抗?fàn)I養(yǎng)因子[14],破壞或阻礙蛋雞對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收,造成蛋白質(zhì)消化率下降,產(chǎn)生食欲不振[15]等癥狀。
在試驗第2周,2 666 mg/kg茶多酚組蛋殼比率顯著低于對照組,這可能與本試驗使用的茶多酚產(chǎn)品中含有部分咖啡堿(6.84%)有關(guān)。有前人研究表明,咖啡堿的攝入會導(dǎo)致鈣的流失和骨質(zhì)疏松等不良反應(yīng),可明顯遏制鈣在消化道中的吸收,使體內(nèi)缺鈣,從而影響蛋殼質(zhì)量,造成蛋殼比率下降[16-17]。
飼糧中添加茶多酚能夠增加雞蛋的哈夫單位,哈夫單位能夠反映蛋的新鮮程度[18]。影響雞蛋哈夫單位的因素有貯存時間和溫度以及蛋雞年齡、應(yīng)激、營養(yǎng)、營養(yǎng)素的補(bǔ)充、疾病等[19-20],在環(huán)境和條件相同的情況下,營養(yǎng)是影響雞蛋哈夫單位的關(guān)鍵因素。自由基會對蛋白質(zhì)造成損傷,導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性或功能喪失[21],而茶多酚具有很強(qiáng)的清除自由基能力,飼糧中添加茶多酚增加雞蛋的哈夫單位的主要原因可能就與其具有抗氧化功能有關(guān)。
兒茶素可能會抑制腸道脂肪的吸收和脂肪合酶的活性,從而造成蛋黃脂質(zhì)形成受阻[22]。本試驗發(fā)現(xiàn)茶多酚對蛋黃比率無顯著影響,可以推測添加茶多酚后蛋重降低并不是因為茶多酚抑制腸道脂肪的吸收和脂肪酶的活性引起的,更可能是因為茶多酚中的抗?fàn)I養(yǎng)因子影響了蛋雞的生產(chǎn)性能。
本試驗中,飼糧中添加茶多酚能夠降低蛋黃中膽固醇的含量,與齊廣海等[23]報道的隨著飼糧中茶多酚添加劑量的增加,蛋黃膽固醇含量逐漸下降的趨勢一致。雞蛋中膽固醇大部分來自母雞肝臟合成的脂蛋白,主要是極低密度脂蛋白(VLDL),其次是卵黃蛋白原,蛋雞肝臟和卵巢是膽固醇生物合成的主要場所,肝臟可以高速度合成膽固醇,并且能夠快速將膽固醇以脂蛋白形式運(yùn)送到血液,血液中的膽固醇大部分隨VLDL轉(zhuǎn)入蛋黃,以產(chǎn)蛋的形式排出[24]。
本試驗中,飼糧中添加不同劑量的茶多酚均降低了蛋雞血清總膽固醇、甘油三酯與低密度脂蛋白膽固醇含量,這與樓洪興等[5]得出的在飼糧中添加0.4%茶多酚可降低46周齡蛋雞血清膽固醇、甘油三酯與低密度脂蛋白膽固醇含量的結(jié)果相似。隨著茶多酚添加劑量的增加,血清甘油三酯含量有降低趨勢,說明脂肪分解增強(qiáng)。茶多酚降血脂作用機(jī)制可能與雌激素有關(guān),茶多酚可通過調(diào)節(jié)雌激素、削弱雌激素維持高血脂的作用,表現(xiàn)出降血脂作用;此外,茶多酚能夠通過抑制體內(nèi)生脂酶活性和基因表達(dá),從而抑制肝臟中脂類的合成。
肝臟在家禽的脂質(zhì)代謝中起著重要的作用,是脂肪酸從頭合成的主要部位[25],占脂肪酸合成量的90%以上。動物體內(nèi)脂肪組織合成與分解的調(diào)控比較復(fù)雜,主要是由脂質(zhì)代謝關(guān)鍵酶來完成,酶蛋白的多寡和活性的高低是由關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量來決定的。AMPK是維持體內(nèi)能量平衡的關(guān)鍵物質(zhì)[26]。AMPK被活化的同時使機(jī)體代謝方向朝著抑制耗能的合成代謝、促進(jìn)產(chǎn)能的分解代謝方向進(jìn)行。AMPK被活化后,可以在許多組織中對脂質(zhì)代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)。在肝臟組織中,AMPK可以促進(jìn)脂肪酸氧化,降低膽固醇、甘油三酯的合成,抑制脂肪酸的產(chǎn)生。本試驗發(fā)現(xiàn),與對照組相比,飼糧中添加666、1 333和2 666 mg/kg茶多酚均可以顯著升高肝臟AMPKmRNA的相對表達(dá)量,對其他肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA的相對表達(dá)量無顯著影響。近幾年的大量研究表明,AMPK基因被激活后,可以降低動物細(xì)胞及機(jī)體中脂肪酸及膽固醇的合成[27]。AMPK可以抑制固醇調(diào)節(jié)元件序列,固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白通過結(jié)合固醇調(diào)節(jié)元件來起到轉(zhuǎn)錄激活LDLR基因的表達(dá),從而加快膽固醇的合成與代謝。AMPK在動物試驗上取得了相當(dāng)多的研究成果,為降低雞蛋中膽固醇的含量提供了新的思路。根據(jù)AMPK在脂質(zhì)代謝中起到的重要作用,推測茶多酚可能通過調(diào)控AMPK基因的表達(dá)進(jìn)而影響蛋雞膽固醇的代謝。
① 飼糧中添加高劑量(1 333和2 666 mg/kg)茶多酚會降低蛋雞的生產(chǎn)性能,但可提高雞蛋的哈夫單位,降低蛋黃膽固醇含量以及血清總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和甘油三酯含量。
② 飼糧中添加高劑量(1 333和2 666 mg/kg)茶多酚上調(diào)了蛋雞肝臟AMPK基因的表達(dá),對肝臟其他脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)沒有產(chǎn)生顯著影響。