慢性鼻-鼻竇炎病人細(xì)菌生物膜的表達(dá)及分布

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 青島 266003 1 耳鼻咽喉頭頸外科； 2 器官移植中心； 3 手術(shù)室)

慢性鼻-鼻竇炎(CRS)是耳鼻喉科常見多發(fā)病，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。研究者們認(rèn)為CRS并非單一因素導(dǎo)致的疾病，多種因素可能獨立或協(xié)同參與了其發(fā)生發(fā)展過程。但臨床上仍有部分病人無論采取系統(tǒng)的保守治療(全身和鼻噴激素、黏液促排劑、抗生素治療)，還是鼻內(nèi)鏡手術(shù)治療，或是手術(shù)結(jié)合藥物的綜合治療，其臨床治療效果仍不滿意。國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌生物膜(BBF)是導(dǎo)致臨床治療CRS效果差的重要影響因素[1-5]。BBF是通過細(xì)菌及其自身分泌的胞外多糖類聚合物相互粘連而成的群落，其可黏附于物體表面，生物膜中的細(xì)菌對抗生素的耐藥性是浮游狀態(tài)的500～1 000倍[6]，因此，確定鼻腔/鼻竇黏膜是否存在BBF可以為臨床治療CRS提供重要參考。2004年CRYER等[7]首次報道了BBF在CRS病人鼻腔/鼻竇黏膜的存在。

文獻(xiàn)報道的CRS病人鼻黏膜BBF檢出的陽性率為25%～100%[8-10]。目前國內(nèi)學(xué)者多以掃描電鏡來觀察BBF，且病例樣本數(shù)較少。本實驗的目的是以激光掃描共聚焦顯微鏡觀察CRS病人鼻腔/鼻竇黏膜表面BBF的形成情況和形態(tài)特點，并比較鼻腔不同解剖部位BBF表達(dá)的差異，分析BBF與CRS的相關(guān)性。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2016年1月—2017年9月在我院住院行鼻內(nèi)鏡手術(shù)治療的病人共67例，其中實驗組分為CRS伴鼻息肉(CRSwNP)組共27例，CRS不伴鼻息肉(CRSsNP)組共25例，病人均符合EPOS-2007所提供的CRS伴/不伴鼻息肉的診斷標(biāo)準(zhǔn)。對照組15例病人中，外傷性視神經(jīng)病病人4例，骨瘤病人3例，單純上頜竇囊腫病人8例；對照組病人均無鼻竇炎或鼻炎病史以及流涕、鼻涕倒流、鼻塞等相關(guān)鼻部癥狀，體格檢查鼻腔黏膜未見異常。所有病人均排除免疫系統(tǒng)疾病及糖尿病、不動纖毛綜合征、術(shù)前激素治療史、妊娠及腫瘤病人。所有病人均同意接受手術(shù)治療及將術(shù)中所取標(biāo)本用于本次研究。

1.2 研究方法

3組病人鼻內(nèi)鏡手術(shù)時由同一術(shù)者取得中鼻甲、鉤突及前篩、后篩黏膜。取下黏膜標(biāo)本后，選取較薄的部分，切除約5～10 mm2大小，置于DMEM高糖培養(yǎng)基中冰袋冷藏，1 h內(nèi)送至我院中心實驗室以生理鹽水反復(fù)洗滌黏膜標(biāo)本3次約10 min。后將標(biāo)本完全置于活/死菌熒光染色劑(BacLight LIVE/DEAD)中，室溫暗室放置15～20 min，具體時間視標(biāo)本的厚薄和大小而定，如果所取標(biāo)本較厚或較大，染色時間需要延長。再以生理鹽水反復(fù)洗滌3次約10 min，去除標(biāo)本表面的染色劑。將洗凈的標(biāo)本置于載玻片上，以防淬滅甘油封片。使用激光掃描共聚焦顯微鏡(分別設(shè)置488和523 nm波長，放大倍數(shù)為63倍)觀察BBF的形態(tài)特點，分析各組間及不同解剖部位生物膜表達(dá)的差異性，并對BBF的存在狀況與部分臨床指標(biāo)的關(guān)系進(jìn)行分析。

1.3 BBF陽性結(jié)果判斷

參考國內(nèi)外文獻(xiàn)資料[11]，激光掃描共聚焦顯微鏡下BBF陽性的判斷標(biāo)準(zhǔn)：在5～10 μm大小的鼻腔/鼻竇黏膜細(xì)胞周圍觀察到適當(dāng)大小及形態(tài)呈現(xiàn)綠色熒光的活菌(直徑為0.5～2 μm)聚集成微群落，并被云霧狀的綠色胞外多糖類物質(zhì)緊密包繞。

1.4 各指標(biāo)評分

鼻部癥狀評分：采用VAS評價方法，鼻部癥狀最嚴(yán)重為10分，無癥狀為0分。鼻內(nèi)鏡評分：根據(jù)1997年Lund-Kennedy鼻內(nèi)鏡評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分；影像學(xué)評分：采用Lund-Mackay評分系統(tǒng)對研究對象的鼻竇CT結(jié)果進(jìn)行評分。

2 結(jié) 果

2.1 BBF的形態(tài)

激光掃描共聚焦顯微鏡下可見，實驗組在5～10 μm大小的鼻竇黏膜細(xì)胞周圍，有棒狀或球形、直徑為0.5～2.0 μm、呈現(xiàn)綠色熒光的活菌聚集成微菌落，被云霧狀的同樣呈現(xiàn)綠色熒光的胞外多糖類物質(zhì)緊密包繞，見圖1。

白色箭頭指向BBF。

2.2 實驗組與對照組BBF表達(dá)結(jié)果

CRSwNP組27例病人中有22例黏膜表面檢測到BBF，陽性率為81.48%；CRSsNP組25例病人中有14例檢測到BBF，陽性率為56.00%；對照組15例病人中未發(fā)現(xiàn)BBF。不同組生物膜表達(dá)陽性率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.957～25.667，P<0.05)。

2.3 鼻腔不同解剖部位BBF表達(dá)結(jié)果

中鼻甲黏膜表面有16例檢測到BBF，陽性率為30.77%；鉤突黏膜表面有25例檢測到BBF，陽性率為48.08%；篩竇黏膜表面有32例檢測到BBF，陽性率為61.54%。中鼻甲BBF表達(dá)的陽性率與篩竇比較，差異有顯著性(χ2=9.905，P<0.05)。

2.4 實驗組中BBF陽性與陰性組臨床部分指標(biāo)的比較

實驗組中BBF陽性的CRS病人(36例)鼻部癥狀評分和鼻竇內(nèi)鏡評分與陰性病人(16例)比較，差異有顯著性(t=5.71、t′=6.62，P<0.05)。而有無吸煙史、有無哮喘病史、既往有無鼻竇手術(shù)史、病史長短及標(biāo)本側(cè)CT評分，兩組之間比較差異無顯著性(P>0.05)。見表1。

表1 實驗組中BBF陽性與陰性組臨床部分指標(biāo)比較

3 討 論

BBF是細(xì)菌在不利于其生長的環(huán)境中通過產(chǎn)生胞外多聚糖被膜，使其相互粘連而形成的微群落。其可以由單一的菌種組成，也可由多種細(xì)菌混合組成。自然界中大約有99%的細(xì)菌以生物膜的形式存在，僅1%的細(xì)菌以浮游方式生存[12]。臨床上許多頑固性、難治性感染都與BBF的形成有關(guān)。

近年來，相關(guān)研究已經(jīng)證實CRS病人鼻黏膜存在BBF。SUN等[13]觀察了31例CRS病人的手術(shù)黏膜樣本，結(jié)果顯示BBF的表達(dá)率為64.51%。張孜等[14]用掃描電鏡觀察了12例CRS病人的手術(shù)黏膜樣本，結(jié)果BBF的表達(dá)率為83.3%。本研究利用激光掃描共聚焦顯微鏡，發(fā)現(xiàn)27例鼻息肉病人中22例可以檢出BBF，陽性率為81.48%，25例CRS病人中有14例可以檢出BBF，陽性率為56.00%，但是對照組15例均沒有檢測出BBF。本研究實驗組與對照組陽性率比較差異有顯著性。這與以往文獻(xiàn)報道的結(jié)果是一致的。提示BBF的存在與CRS的發(fā)病尤其是鼻息肉的發(fā)病密切相關(guān)，BBF可能是CRS的發(fā)病原因之一。但也有部分學(xué)者研究認(rèn)為CRS的發(fā)病與BBF無相關(guān)性[15-17]。這也許是由于檢測方法不同導(dǎo)致的。目前檢測BBF的主要方法有透射電鏡、掃描電鏡、原位熒光雜交及激光掃描共聚焦顯微鏡等。激光掃描共聚焦顯微鏡可以對細(xì)菌及生物膜中各種成分進(jìn)行不同顏色的熒光染色，且避免對BBF結(jié)構(gòu)的破壞，對標(biāo)本可以進(jìn)行無損傷“光學(xué)切片”和成像，可做活體研究。HA等[18]認(rèn)為激光掃描共聚焦顯微鏡是目前檢測鼻竇黏膜BBF的最佳方法。本實驗采用活/死菌熒光染色劑，將活體的鼻腔/鼻竇黏膜細(xì)胞或細(xì)菌染成綠色，將死亡的細(xì)胞或細(xì)菌染為紅色。為保證實驗的可靠性，盡可能不破壞BBF在機體內(nèi)的原始狀態(tài)，經(jīng)鼻內(nèi)鏡留取鼻黏膜標(biāo)本后，立即進(jìn)行染色及激光掃描共聚焦顯微鏡鏡下觀察，標(biāo)本留取到掃描完成的時間窗控制在60 min內(nèi)。另外本研究還發(fā)現(xiàn)，BBF在篩竇黏膜表達(dá)的陽性率較在中鼻甲表達(dá)的陽性率明顯增高，提示BBF可能更容易定植于鼻腔深部無明顯氣流的部位。BBF在鼻腔不同解剖部位的表達(dá)之前未見報道。這也可以解釋為什么鼻息肉組BBF的陽性率更高，因為大部分的鼻息肉起源于篩竇。

CRS病人的病史、主觀癥狀、鼻腔局部檢查、影像學(xué)檢查是反應(yīng)疾病嚴(yán)重程度、決定治療方式的重要指征。為了研究BBF與CRS的相關(guān)性，本研究采用病史長短、癥狀評分、Lund-Kennedy鼻內(nèi)鏡評分及Lund-Mackay CT影像學(xué)評分等評價指標(biāo)進(jìn)行分析。本研究中，生物膜陽性的CRS病人的癥狀評分、鼻內(nèi)鏡評分與生物膜陰性病人比較，差異有顯著性，提示BBF可能與CRS的病情嚴(yán)重程度相關(guān)。雖然本研究BBF陽性病人鼻竇影像學(xué)評分與陰性病人無明顯差異，但是也表現(xiàn)出升高的趨勢。

36例BBF陽性的CRS病人中，有鼻竇手術(shù)史的病人有6例(16.67%)，而16例BBF陰性的CRS病人中，有鼻竇手術(shù)史的病人僅1例(6.25%)，提示BBF的存在增加了CRS的難治性。雖然兩組經(jīng)校正的卡方檢驗，差異無顯著性，但是手術(shù)有可能造成鼻竇黏膜的損傷，繼而容易導(dǎo)致細(xì)菌的定植。因此術(shù)者在術(shù)中應(yīng)強化無菌觀念，嚴(yán)格無菌技術(shù)操作，有鼻腔疾病的病人應(yīng)保持鼻部清潔，減少CRS的發(fā)病風(fēng)險。在后續(xù)研究中，可以通過加大樣本量，對手術(shù)與BBF關(guān)系做進(jìn)一步的觀察。FERGUSON等[19]認(rèn)為手術(shù)是清除CRS病人BBF的唯一手段，但由于目前技術(shù)限制，鼻內(nèi)鏡手術(shù)過程中發(fā)現(xiàn)BBF黏附的確切部位和范圍尚未成為可能，BBF的實驗室檢測手段仍不成熟，無法為臨床手術(shù)治療提供有力的支持，手術(shù)無法達(dá)到徹底清除生物膜的目的。術(shù)中殘留的BBF成為鼻竇炎復(fù)發(fā)的隱患，多數(shù)狀態(tài)下細(xì)菌蟄伏不表現(xiàn)炎癥癥狀，一旦達(dá)到其良好的生長條件，細(xì)菌將會以浮游狀態(tài)再次活躍起來，炎性癥狀隨之出現(xiàn)。BBF的存在，可能是CRS難治的原因之一，也可能是鼻內(nèi)鏡手術(shù)后部分病人療效欠佳的原因之一。

隨著近年來對BBF的特性、結(jié)構(gòu)及耐藥機制的研究，人們對其有了較深的了解，但是BBF在CRS發(fā)病中的具體作用機制尚未完全闡明，未來的研究目標(biāo)是找到BBF可靠規(guī)范的檢測標(biāo)準(zhǔn)及方法，同時還應(yīng)找到BBF形成發(fā)生的根源，探討阻止BBF形成的方法，例如通過藥物控制的手段阻止其形成，并進(jìn)一步探索如何有效清除已存在的生物膜，使CRS得到有效控制。