藏藥綠蘿花彗星試驗(yàn)（SCGE）研究

陳 明，丁淑梅，朱子鳳，劉 群

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.西南民族大學(xué)校醫(yī)院，四川 成都 610041）

藏藥材綠蘿花（Araceae），為天南星科喜林芋屬植物綠蘿花的干燥花蕾，是一種具有民族特色的習(xí)用藥材，多以晾干的花蕾泡水飲用，用于糖尿病、高血壓、高血脂、冠心病、脈管炎等慢性疾病的預(yù)防和治療[1].目前對(duì)綠蘿花的藥效學(xué)研究多集中在降血糖[2-5]、降血脂[6]、抗氧化[7-9]及對(duì)機(jī)體免疫功能影響[10-11]等方面的研究，對(duì)其毒理學(xué)尤其是對(duì)遺傳物的影響還末見研究報(bào)道.藥物對(duì)于DNA損害越嚴(yán)重，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的斷裂片段越多，長(zhǎng)度也越大.而研究藏藥綠蘿花對(duì)于遺傳物質(zhì)的影響最簡(jiǎn)單有效的檢測(cè)方法就是彗星實(shí)驗(yàn).彗星實(shí)驗(yàn)又稱單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù) （SCGE），該技術(shù)是近年來(lái)興起的一種簡(jiǎn)單，快速，準(zhǔn)確，有效的細(xì)胞核DNA損傷檢測(cè)技術(shù).該技術(shù)通過(guò)測(cè)定DNA遷移部分的光密度或遷移長(zhǎng)度就可以測(cè)定單個(gè)細(xì)胞DNA損傷程度，從而確定受試物的作用劑量與DNA損傷效應(yīng)的關(guān)系.本研究采用水萃取法制備綠蘿花干膏制劑，根據(jù)遺傳毒性研究試驗(yàn)中的單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)及其判定標(biāo)準(zhǔn)，研究不同劑量綠蘿花對(duì)CHL細(xì)胞（中國(guó)倉(cāng)鼠肺成纖維細(xì)胞系為研究對(duì)象）DNA的影響，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下.

1 材料

1.1 受試細(xì)胞及藥物

受試細(xì)胞中國(guó)倉(cāng)鼠肺成纖維細(xì)胞系（CHL），由上海細(xì)胞生物學(xué)研究所提供.

受試藥物綠蘿花干燥花蕾，由四川宇妥藏藥藥業(yè)有限責(zé)任公司提供，由西南大學(xué)園藝園林學(xué)院鑒定為天南星科喜林芋屬植物藏藥材綠蘿花（Araceae），鑒定人:李先源.

1.2 主要試劑及儀器

細(xì)胞培養(yǎng)基 DMEM（AB216032，Hyclone）；絲裂霉素 C（MMC，MW33433，瑞氏羅氏有限公司）；環(huán)磷酰胺（CP，M0915A，大連美侖生物）.纖維素微孔濾膜（0.22 μM，Scapo33RB）；倒置顯微鏡 （OLYMPUS CX21，Tokyo Japan）；電泳儀（DYY-6C，北京六一儀器廠）；熒光顯微鏡（DM5000B，北京中顯恒業(yè)儀器儀表有限公司）等.

2 方法

2.1 受試藥物的制備

按照優(yōu)化后的水提工藝[12]:浸泡0.5 h、20倍加水量、1 h煎煮時(shí)間、煎煮3次，制備綠蘿花干膏制劑，干膏得率22.3%.參考韓金潭等[13]研究（綠蘿花對(duì)成纖維細(xì)胞最大無(wú)毒濃度，TC0＝25%），換算成生藥含量，DMEM配制成生藥濃度為0.224 g/mL（5%）、0.448 g/mL（10%）、0.896 g/mL（20%）的綠蘿花細(xì)胞受試液，經(jīng)纖維素微孔濾膜（孔徑0.22 μM）濾過(guò)，4℃冰箱保存?zhèn)溆?

2.2 彗星試驗(yàn)（單細(xì)胞凝膠電泳）

取對(duì)數(shù)增殖期的CHL細(xì)胞，調(diào)整密度為1×105/mL，隨機(jī)分成3個(gè)受試藥物劑量組、陽(yáng)性藥物組、3個(gè)受試藥物劑量＋陽(yáng)性藥物組并設(shè)DMEM組；陽(yáng)性藥物為環(huán)磷酰胺（活化條件下，20 μg/mL）和絲裂霉素C（非活化條件下，0.25 μg/mL）.每組分別做 1 次、2次、3次染毒，4個(gè)重復(fù).

彗星試驗(yàn)操作步驟參考Schnurstein A.等[14]研究并作適當(dāng)改進(jìn)；彗星圖像觀察參考Wu J等[15]研究.400倍熒光顯微鏡下觀察單細(xì)胞電泳圖像.每片隨機(jī)計(jì)數(shù)25～50個(gè)細(xì)胞.每一個(gè)劑量組隨機(jī)分析100個(gè)細(xì)胞.正常對(duì)照組具有完整的細(xì)胞核，DNA熒光圖像為紅色圓球形；陽(yáng)性藥物組可見明顯彗星樣拖尾現(xiàn)象.計(jì)算機(jī)CASP系統(tǒng)自動(dòng)采集拖尾率（SCGE%、彗星率）、彗星頭部 DNA率（HDNA%）、尾部 DNA率（TDNA%）、尾長(zhǎng)（TL）、尾距（TM）等指標(biāo).SCGE%:拖尾率（彗星率），拖尾細(xì)胞個(gè)數(shù)和全部細(xì)胞個(gè)數(shù)的比值，反映 DNA損傷情況；HDNA%:頭部熒光亮度/（頭部熒光亮度＋尾部熒光亮度）×100%，反映DNA損傷情況；TDNA%:尾部熒光亮度/（頭部熒光亮度＋尾部熒光亮度）×100% ，反映DNA損傷情況；TL:尾長(zhǎng)是指細(xì)胞的DNA片段遷移長(zhǎng)度，反映DNA斷裂的程度；TM:尾長(zhǎng)×尾部 DNA含量，反映DNA損傷情況.參考Kamer等[16]的損傷分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將DNA損傷程度分為五級(jí):

0級(jí)（無(wú)損傷細(xì)胞）:細(xì)胞核清楚、頭部緊密、無(wú)彗星尾狀現(xiàn)象；

1級(jí)（輕度損傷細(xì)胞）:胞核清楚、尾長(zhǎng)不超過(guò)10 μm；

2級(jí)（中度損傷細(xì)胞）:胞核清楚、尾長(zhǎng)在10～30 μm；

3級(jí)（高度損傷細(xì)胞）:尾長(zhǎng)在30～40 μm；

4級(jí)（重度損傷細(xì)胞）:胞核與彗尾不能區(qū)分、尾長(zhǎng)超過(guò)40 μm.

2.3 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果與分析

3.1 CHL細(xì)胞彗星圖像

0～4級(jí)CHL細(xì)胞DNA損傷彗星圖像見圖1.

圖1 CHL細(xì)胞彗星圖像（Gold view熒光染色，400×）Fig.1 The comet picture of CHL（Gold view staining，400 × ）注:圖1-A為無(wú)損傷細(xì)胞；圖1-B為輕度損傷細(xì)胞；圖1-C為中度損傷細(xì)胞；圖1-D為高度損傷細(xì)胞；圖1-E為重度損傷細(xì)胞

圖1 A顯示，在堿性電解質(zhì)作用下，熒光顯微鏡下的CHL細(xì)胞DNA發(fā)生解螺旋、斷裂及片段釋放出來(lái)（呈單鏈）；在Gold view熒光染色劑作用下呈紅色熒光，且細(xì)胞核清楚、頭部緊密、呈球形無(wú)彗星尾狀現(xiàn)象，表明該細(xì)胞DNA未受到損傷.圖1B顯示，在顯微鏡下，CHL細(xì)胞DNA發(fā)生解螺旋、斷裂及片段釋放出來(lái)（呈單鏈）；熒光染色呈紅色熒光，細(xì)胞DNA形態(tài)呈球形但邊緣有些許拖尾，細(xì)胞的DNA受到了損傷，但細(xì)胞胞核清楚、尾長(zhǎng)沒(méi)有超過(guò)10 μm，為1級(jí)輕度損傷細(xì)胞.圖1C顯示，在顯微鏡下，CHL細(xì)胞DNA發(fā)生解螺旋、斷裂及片段釋放出來(lái)（呈單鏈）；呈紅色熒光，細(xì)胞DNA形態(tài)呈球形但邊緣有一定量的拖尾，胞核清楚、尾長(zhǎng)在10～30 μm，細(xì)胞的DNA受到了中度損傷，為2級(jí)中度損傷細(xì)胞.圖1D顯示，顯微鏡下，CHL細(xì)胞DNA發(fā)生解螺旋、斷裂及片段釋放出來(lái)（呈單鏈）；呈紅色熒光，細(xì)胞DNA形態(tài)呈球形但邊緣有大量的拖尾現(xiàn)象，且尾長(zhǎng)在30～40 μm，此細(xì)胞的DNA受到了高度的損傷，為3級(jí)高度損傷細(xì)胞.圖1E顯示，顯微鏡下，CHL細(xì)胞DNA發(fā)生解螺旋、斷裂及片段釋放出來(lái)（呈單鏈）；呈紅色熒光，細(xì)胞DNA形態(tài)呈分散狀有大量的拖尾現(xiàn)象，胞核與彗星的彗尾不能區(qū)分且尾長(zhǎng)超過(guò)40 μm，為4級(jí)重度損傷細(xì)胞.

3.2 CHL細(xì)胞彗星圖像檢測(cè)指標(biāo)

3.2.1 活化條件下CHL細(xì)胞彗星圖像檢測(cè)指標(biāo)

活化條件下CHL細(xì)胞彗星圖像檢測(cè)指標(biāo)結(jié)果見表1、表2.

表1 加S9彗星試驗(yàn)結(jié)果組間比較（%，μm，±sE，n＝4）Table 1 Comparison of SCGE of Scindepus aureus with S9 between groups（%，μm，±sE，n＝4）

表1 加S9彗星試驗(yàn)結(jié)果組間比較（%，μm，±sE，n＝4）Table 1 Comparison of SCGE of Scindepus aureus with S9 between groups（%，μm，±sE，n＝4）

組別 0.224g/mL 0.448g/mL 0.896g/mL CP DMEM 0.224g/mL＋CP 0.448g/mL＋CP 0.896g/mL＋CP SCGE%1 4.7±1.1a 5.9±1.5a 7.2±2.7a 95.4±0.5b 4.2±0.5a 92.6±1.0b 88.4±0.8b 93.2±0.9b SCGE%2 5.5±0.7a 6.4±2.1a 5.5±1.9a 97.6±0.6b 5.1±0.2a 93.4±2.2b 91.5±1.7b 95.3±1.1b SCGE%3 7.1±1.5a 4.2±2.8a 6.7±2.4a 98.1±1.3b 3.7±0.2a 89.7±2.1b 85.3±1.6b 93.4±2.1b HDNA%1 93.7±3.1a 86.7±4.1a 91.3±3.0a 27.6±0.7b 97.5±3.9a 30.0±1.9b 33.7±2.4b 31.2±0.7b

注:同行右肩有相同小寫字母的數(shù)據(jù)表示無(wú)顯著差異，P＞0.05；同行右肩無(wú)相同小寫字母有相同大寫字母的數(shù)據(jù)表示有顯著差異，0.01＜P＜0.05；同行右肩無(wú)相同字母的數(shù)據(jù)表示有極顯著差異，P＜0.01.

表2 加S9彗星試驗(yàn)結(jié)果組內(nèi)比較（%，μm，±sE，n＝4）Table 2 Comparison of SCGE of Scindepus aureus with S9 within groups（%，μm，X ±SE，n＝4）

表2 加S9彗星試驗(yàn)結(jié)果組內(nèi)比較（%，μm，±sE，n＝4）Table 2 Comparison of SCGE of Scindepus aureus with S9 within groups（%，μm，X ±SE，n＝4）

注:同列相同指標(biāo)右肩有相同小寫字母的數(shù)據(jù)表示無(wú)顯著差異，P＞0.05；同列右肩無(wú)相同小寫字母有相同大寫字母的數(shù)據(jù)表示有顯著差異，0.01＜P＜0.05；同列右肩無(wú)相同字母的數(shù)據(jù)表示有極顯著差異，P＜0.01.

組別 0.224g/mL 0.448g/mL 0.896g/mL CP DMEM 0.224g/mL＋CP 0.448g/mL＋CP 0.896g/mL＋CP SCGE%1 4.7±1.1a 5.9±1.5a 7.2±2.7a 95.4±0.5b 4.2±0.5a 92.6±1.0b 88.4±0.8b 93.2±0.9b SCGE%2 5.5±0.7a 6.4±2.1a 5.5±1.9a 97.6±0.6b 5.1±0.2a 93.4±2.2b 91.5±1.7b 95.3±1.1b SCGE%3 7.1±1.5a 4.2±2.8a 6.7±2.4a 98.1±1.3b 3.7±0.2a 89.7±2.1b 85.3±1.6b 93.4±2.1b HDNA%1 93.7±3.1a 86.7±4.1a 91.3±3.0a 27.6±0.7b 97.5±3.9a 30.0±1.9b 33.7±2.4b 31.2±0.7b HDNA%2 92.8±1.4a 92.3±1.6a 88.8±1.1a 28.3±0.8b 98.3±2.5a 26.2±2.2b 35.5±1.1b 28.6±1.3b HDNA%3 95.2±2.1a 90.5±0.9a 85.9±2.1a 27.4±0.5b 98.3±1.9a 28.3±1.7b 30.8±3.3b 30.7±1.6b TDNA%1 1.4±0.3a 3.5±1.1a 4.7±2.1a 78.3±2.2b 1.3±0.4a 74.2±2.1b 73.2±3.9b 75.8±3.1b TDNA%2 1.8±0.8a 4.2±1.7a 4.7±1.8a 83.5±2.6b 0.9±2.1a 82.1±1.5b 65.5±2.5b 76.1±1.1b TDNA%3 2.3±0.1a 3.6±1.2a 4.2±1.4a 85.6±1.7b 1.5±0.3a 79.2±0.9b 67.3±2.5b 81.5±1.5b TL1（μm） 4.0±0.8a 6.6±3.0a 10.8±2.3a 73.5±2.1b 3.3±0.4a 74.2±2.1b 69.2±1.5b 72.8±3.7b TL2（μm） 3.7±0.3a 8.5±1.4a 16.8±2.8a 81.2±1.3b 2.8±0.3a 81.5±1.3b 69.5±0.6b 77.6±1.1b TL3（μm） 4.8±1.3a 9.1±1.6a 17.4±1.3a 82.2±2.4b 2.9±0.4a 78.2±1.6b 70.1±1.4b 78.4±2.3b TM1（μm） 0.05±0.02a 0.23±0.08a 0.50±0.07a 55.55±2.17b 0.04±0.01a 55.05±3.62b 50.65±4.46b 55.18±5.43b TM2（μm） 0.06±0.02a 0.31±0.01a 0.78±0.05a 67.80±3.04b 0.02±0.02a 66.17±2.86b 45.52±3.25b 59.06±3.36b TM3（μm） 0.11±0.02a 0.25±0.05a 0.73±0.03a 70.36±3.28b 0.04±001a 43.59±1.96b 52.62±2.48b 63.89±2.96b

表1顯示，加入活化劑S9，細(xì)胞分別接毒一、二、三次，0.224 g/mL、0.448 g/mL、0.896 g/mL 綠蘿花組的拖尾率（SCGE%）、頭部DNA率（HDNA%）、尾部DNA率（TDNA%）、尾長(zhǎng)（TL）及尾距（TM）和 DMEM組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但與環(huán)磷酰胺組比較有極顯著差異（P＜0.01），說(shuō)明環(huán)磷酰胺具有很強(qiáng)的致CHL細(xì)胞DNA損傷的作用，表現(xiàn)為SCGE%升高、HDNA%下降、TDNA%升高，TL和TM均增加（均超過(guò)40 μm），而綠蘿花在最大無(wú)毒濃度下（細(xì)胞毒性濃度）的三個(gè)劑量對(duì)CHL細(xì)胞DNA無(wú)影響；0.224 g/mL綠蘿花 ＋CP組、0.448 g/mL綠蘿花 ＋CP組和0.896 g/mL綠蘿花＋CP組的SCGE%、HDNA%、TD-NA%、TL和TM與DMEM組比較有極顯著差異（P＜0.01），并與環(huán)磷酰胺組相當(dāng)（P＞0.05）.表2顯示，各組染毒一、二、三次，CHL細(xì)胞彗星指標(biāo)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）.

試驗(yàn)結(jié)果表明，加入S9，環(huán)磷酰胺可引起CHL細(xì)胞DNA損傷，表現(xiàn)為 SCGE%升高、HDNA%下降、TDNA%升高，TL和 TM 均增加，0.224 g/mL、0.448 g/mL、0.896 g/mL綠蘿花對(duì)CHL細(xì)胞DNA既無(wú)損傷也無(wú)損傷保護(hù)作用.

3.2.2 非活化條件下CHL細(xì)胞彗星圖像檢測(cè)指標(biāo)

非活化條件下CHL細(xì)胞彗星圖像檢測(cè)指標(biāo)結(jié)果見表3、表4.

表3 不加S9彗星試驗(yàn)結(jié)果組間比較（%，μm，±sE，n＝4）Table 3 Comparison of SCGE of Scindepus aureus without S9 between groups（%，μm，X ±SE，n＝4）

表3 不加S9彗星試驗(yàn)結(jié)果組間比較（%，μm，±sE，n＝4）Table 3 Comparison of SCGE of Scindepus aureus without S9 between groups（%，μm，X ±SE，n＝4）

注:同表1.

組別 0.224g/mL 0.448g/mL 0.896g/mL MMC DMEM 0.224g/mL＋MMC 0.448g/mL＋MMC 0.896g/mL＋MMC SCGE%1 2.8±0.8a 7.2±1.6a 7.3±1.1a 90.8±0.2b 4.7.±0.1a 94.1±0.6b 92.5±0.4b 92.8±0.1b SCGE%2 5.8±0.6a 8.3±1.5a 5.9±1.9a 95.5±1.3b 3.3±0.4a 93.7±0.8b 95.3±1.3b 92.4±1.6b SCGE%3 8.3±1.2a 6.1±3.7a 9.5±1.8a 98.1±1.6b 3.9±0.2a 93.2±2.4b 83.5±2.6b 92.6±1.7b HDNA%1 93.5±2.1a 88.2±2.6a 96.9±3.1a 30.5±0.3b 98.1±2.7a 32.8±1.4b 27.6±1.8b 32.8±1.2b HDNA%2 89.7±0.9a 91.9±0.8a 90.2±2.1a 32.2±0.2b 97.3±2.2a 30.1±1.7b 25.4±1.2b 33.6±0.9b HDNA%3 93.8±1.1a 90.7±1.6a 95.9±0.5a 30.8±0.4b 95.2±1.5a 32.5±2.2b 7.8±1.3b 34.7±1.1b TDNA%1 2.3±1.2a 4.2±0.6a 6.8±1.6a 79.5±1.2b 1.7±1.6a 78.6±1.6b 67.8±1.9b 83.2±1.1b TDNA%2 0.7±0.2a 5.9±1.4a 8.4±1.4a 91.7±2.1b 2.8±1.3a 88.4±2.2b 71.4±2.5b 81.9±0.7b TDNA%3 2.2±0.2a 7.3±1.1a 7.5±1.4a 87.2±1.1b 1.7±0.4a 78.3±1.1b 76.5±3.3b 85.0±2.8b TL1（μm） 5.6±0.7a 12.1±3.0a 16.5±2.3a 78.8±3.3b 5.1±0.1a 66.3±1.8b 71.6±2.1b 88.8±1.5b TL2（μm） 7.3±1.0a 15.5±1.4a 16.2±1.8a 69.7±2，7b 6.8±0.6a 84.8±2.1b 68.3±1.9b 67.4±2.2b TL3（μm） 8.5±1.2a 17.1±1.6a 17.1±1.6a 88.5±1.4b 6.9±0.2a 89.5±0.7b 78.2±2.3b 88.4±1.3b TM1（μm） 0.12±0.01a0.50±0.07a1.12±0.02a62.64±2.06b0.08±0.07a 52.11±2.18b 48.54±4.48b 73.88±5.43b TM2（μm） 0.51±0.01a0.91±0.05a1.36±0.08a63.91±4.09b0.19±0.04a 74.96±2.32b 48.76±2.62b 55.20±2.26b TM3（μm） 0.18±0.07a 1.24±0.08 1，28±0.02a77.17±2.22b0.11±0.07a 70.07±2.85b 59.82±2.33b 78.49±2.92b

表4 不加S9彗星試驗(yàn)結(jié)果組內(nèi)比較（%，μm，±sE，n＝4）Table 4 Comparison of SCGE of Scindepus aureus without S9 within groups（%，μm，±sE，n＝4）

表4 不加S9彗星試驗(yàn)結(jié)果組內(nèi)比較（%，μm，±sE，n＝4）Table 4 Comparison of SCGE of Scindepus aureus without S9 within groups（%，μm，±sE，n＝4）

組別 0.224g/mL 0.448g/mL 0.896g/mL MMC DMEM 0.224g/mL＋MMC 0.448g/mL＋MMC 0.896g/mL＋MMC SCGE%1 2.8±0.8a 7.2±1.6a 7.3±1.1a 90.8±0.2b 4.7.±0.1a 94.1±0.6b 92.5±0.4b 92.8±0.1b SCGE%2 5.8±0.6a 8.3±1.5a 5.9±1.9a 95.5±1.3b 3.3±0.4a 93.7±0.8b 95.3±1.3b 92.4±1.6b SCGE%3 8.3±1.2a 6.1±3.7a 9.5±1.8a 98.1±1.6b 3.9±0.2a 93.2±2.4b 83.5±2.6b 92.6±1.7b HDNA%1 93.5±2.1a 88.2±2.6a 96.9±3.1a 30.5±0.3b 98.1±2.7a 32.8±1.4b 27.6±1.8b 32.8±1.2b HDNA%2 89.7±0.9a 91.9±0.8a 90.2±2.1a 32.2±0.2b 97.3±2.2a 30.1±1.7b 25.4±1.2b 33.6±0.9b HDNA%3 93.8±1.1a 90.7±1.6a 95.9±0.5a 30.8±0.4b 95.2±1.5a 32.5±2.2b 27.8±1.3b 34.7±1.1b TDNA%1 2.3±1.2a 4.2±0.6a 6.8±1.6a 79.5±1.2b 1.7±1.6a 78.6±1.6b 67.8±1.9b 83.2±1.1b TDNA%2 0.7±0.2a 5.9±1.4a 8.4±1.4a 91.7±2.1b 2.8±1.3a 88.4±2.2b 71.4±2.5b 81.9±0.7b TDNA%3 2.2±0.2a 7.3±1.1a 7.5±1.4a 87.2±1.1b 1.7±0.4a 78.3±1.1b 76.5±3.3b 85.0±2.8b TL1（μm） 5.6±0.7a 12.1±3.0a 16.5±2.3a 78.8±3.3b 5.1±0.1a 66.3±1.8b 71.6±2.1b 88.8±1.5b TL2（μm） 7.3±1.0a 15.5±1.4a 16.2±1.8a 69.7±2，7b 6.8±0.6a 84.8±2.1b 68.3±1.9b 67.4±2.2b TL3（μm） 8.5±1.2a 17.1±1.6a 17.1±1.6a 88.5±1.4b 6.9±0.2a 89.5±0.7b 78.2±2.3b 88.4±1.3b

注:同表2.

表3顯示，在沒(méi)有加入S9活化劑情況下，分別接毒一、二、三次，0.224 g/mL、0.448 g/mL、0.896 g/mL綠蘿花組的拖尾率（SCGE%）、頭部 DNA率（HDNA%）、尾部 DNA 率（TDNA%）、尾長(zhǎng)（TL）和尾距（TM）和DMEM組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與絲裂霉素C組比較差異極顯著（P＜0.01），說(shuō)明絲裂霉素C（MMC）具有很強(qiáng)的致CHL細(xì)胞DNA損傷的作用，表現(xiàn)為SCGE% 升高、HDNA%下降、TDNA%升高，TL和 TM 均增加（均超過(guò)40 μm）；0.224 g/mL綠蘿花 ＋MMC組、0.448 g/mL綠蘿花 ＋MMC組和0.896 g/mL綠蘿花＋MMC組的SCGE%、HDNA%、TDNA%、TL和TM與DMEM組比較有極顯著差異（P＜0.01），并與MMC 組相當(dāng)（P ＞0.05）.表4顯示，各組染毒一、二、三次，CHL細(xì)胞彗星指標(biāo)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）.

試驗(yàn)結(jié)果表明，在不加S9，絲裂霉素C可引起CHL細(xì)胞DNA損傷，表現(xiàn)為SCGE%升高、HDNA%下降、TDNA%升高，TL和 TM均增加，0.224 g/mL、0.448 g/mL、0.896 g/mL綠蘿花對(duì)CHL細(xì)胞DNA既無(wú)損傷也無(wú)損傷保護(hù)作用.

4 討論和結(jié)論

細(xì)胞核DNA為負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)，一般情況下，偶然的DNA單鏈斷裂對(duì)核酸分子雙股螺旋結(jié)構(gòu)連續(xù)性影響不大，而且不易釋放出來(lái)，但DNA殘留會(huì)形成類核，如果類核中的DNA有斷裂，斷裂點(diǎn)引起DNA致密的超螺旋結(jié)構(gòu)松散，在類核外就會(huì)形成一個(gè)DNA暈圈，在電場(chǎng)中，DNA斷片可向陽(yáng)極遷移，經(jīng)熒光染色后，在陽(yáng)極方向可見形似彗星的特征性圖像，通過(guò)測(cè)量彗星尾部的長(zhǎng)度、面積和熒光強(qiáng)度等指標(biāo)可以對(duì)DNA損傷程度進(jìn)行定量分析.單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)（Single cell e-lectrophoresis assay，SCGE）的依據(jù)是受試細(xì)胞在致突變劑的作用下，經(jīng)過(guò)裂解解旋中和染色后包埋在瓊脂糖里的細(xì)胞內(nèi)DNA脫離而出從而會(huì)產(chǎn)生形似彗星的圖像，通過(guò)檢測(cè)尾部的長(zhǎng)度和DNA含量來(lái)判斷待測(cè)藥物是否具有致突變性和抗突變性，與DNA電泳梯度法、TUNUL法等相比，具有操作簡(jiǎn)單、試驗(yàn)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn).且該技術(shù)既可用于活細(xì)胞，也可用于死亡細(xì)胞DNA的分析[17～20].本研究以CHL細(xì)胞為研究對(duì)象，以拖尾率（SCGE%）、頭部 DNA率（HDNA%）、尾部 DNA 率（TDNA%）、尾長(zhǎng)（TL）和尾距（TM）為考核指標(biāo)，將CHL細(xì)胞分為正常對(duì)照組、不同劑量綠蘿花并以環(huán)磷酰胺、絲裂霉素C為對(duì)照，在傳統(tǒng)遺傳毒理學(xué)研究基礎(chǔ)上，采用多次染毒研究方法，研究綠蘿花干膏制劑對(duì)細(xì)胞DNA的影響.研究結(jié)果表明:環(huán)磷酰胺和絲裂霉素C可引起CHL細(xì)胞大量拖尾、HDNA%下降、TDNA%上升，TL和TM均超過(guò)40μm；最大無(wú)毒濃庋下的三個(gè)劑量綠蘿花對(duì)CHL細(xì)胞既無(wú)致突變作用也無(wú)致突變保護(hù)作用.

綠蘿花為藏族地區(qū)珍貴藥材，民間以泡茶習(xí)俗方式預(yù)防和治療高血壓、高血脂、糖尿病及各類血管炎癥，目前對(duì)綠蘿花的藥理學(xué)研究主要集中在降血糖、降血脂、抗氧化及對(duì)機(jī)體免疫功能影響等方面，對(duì)其毒理學(xué)研究尤其是長(zhǎng)期服用后對(duì)遺傳物的影響還末見報(bào)道.本研究結(jié)果表明綠蘿花體外對(duì)細(xì)胞染色體DNA結(jié)構(gòu)無(wú)影響，為臨床安全用藥提供了科學(xué)依據(jù).其對(duì)細(xì)胞染色體DNA的慢性及亞慢性毒理作用還有待進(jìn)一步研究.