不同胎次及病牛牛乳中主要蛋白質(zhì)成分的研究

曹志軍，趙雪平，劉敏，趙亞利，李洵洲

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學職業(yè)技術(shù)學院，內(nèi)蒙古包頭，014109)

0 引 言

牛乳所含營養(yǎng)成分齊全，其中乳蛋白是乳中主要的營養(yǎng)成分，其組成較復雜。乳蛋白除了提供營養(yǎng)和具有許多生理功能外，還是遺傳信息的攜帶者，因此研究乳蛋白的組成和含量對于評價乳的營養(yǎng)價值和加工特性以及指導遺傳育種具有非常重要的意義。乳中的蛋白質(zhì)主要由酪蛋白和乳清蛋白組成，酪蛋白主要由αs-CN、β-CN和κ-CN組成[1]，其含量及占總酪蛋白的比率影響乳的組成及乳的凝乳特性[2-3]；乳清蛋白主要由α-La和β-Lg等組成[4-5]，能夠發(fā)生相互作用并且凝集[6]。乳蛋白具有遺傳多態(tài)性，每種乳蛋白有一種或幾種遺傳性變異體[7]，奶牛胎次、哺乳動物種類、品種及動物的泌乳期和飼喂條件等因素影響乳中乳蛋白的含量。目前，乳蛋白分離和測定的方法有高效毛細管電泳[8]、雙向凝膠電泳[9]和反相高效液相色譜法[10]，具有高分辨率和高靈敏度的液相色譜法（RP-HPLC）在分離和測定荷斯坦因奶牛[11]、瘤牛[12]、西門塔爾牛[13]以及其它雜交奶?；蚨鄳B(tài)性與其產(chǎn)奶性能的研究中也得到了廣泛應(yīng)用。本文采用SDS-PAGE和RP-HPLC相結(jié)合方法分析不同胎次、乳房炎乳及病牛牛乳中的乳蛋白，了解其組成成分及含量分布，為比較分析不同胎次與病牛牛乳中乳蛋白的差異奠定基礎(chǔ)，為牛乳的加工選擇原料乳提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

安捷倫1220型高效液相色譜儀，M illpore超純水系統(tǒng)，離心機，DYY—III型穩(wěn)壓穩(wěn)流定時電泳儀。

丙烯酰胺，Tris-HCL，N,N-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)，十二烷基硫酸鈉(SDS)，過硫酸銨(Ap)，四甲基乙二胺(TEM ED)，巰基乙醇，考馬斯亮蘭。

三氟乙酸(TFA)，乙腈，尿素，三羥甲基氨基甲烷(T ris堿)，檸檬酸鈉和二硫蘇糖醇（DTT）均為分析純；實驗用水均為M illpore超純水；αs-CN，β-CN，κ-CN，α-La和β-Lg標準品均購自sigm a公司。

1.2 方法

1.2.1 SDS-PAGE凝膠電泳的測定

SDS-PAGE電泳采用質(zhì)量分數(shù)的3%的濃縮膠和質(zhì)量分數(shù)為12.5%的分離膠進行電泳測定[14]。

1.2.2 溶液制備

工作液A為165 mmoL/LT ris堿，8 mol/L尿素，5.37 mmol/L檸檬酸鈉，19.5 mm ol/LDDT的混合溶液；工作液B為4.5m o l/L尿素-0.1%三氟乙酸(TFA)。

1.2.3 樣品制備

（1）樣品采集。牛奶樣品均采自呼和浩特市犇騰牧業(yè)牛場。選取不同胎次健康荷斯坦奶牛50頭，病牛乳和乳房炎乳各50頭，每頭采集50 m L奶樣，各取500μL分裝于離心管中。

（2）樣品制備。各奶樣中加入等體積的工作液A，樣品混合后振蕩10 s混勻，室溫培養(yǎng)1 h。然后在4℃下以3 000 r/min離心10 min，除去表層乳脂，取一定體積下層清液，加入工作液B（1∶3體積比）稀釋，混勻，過濾到進樣瓶中待測。

1.2.4 標準品制備

準確稱取各蛋白標準品，配制成10m g/m L溶液，后續(xù)操作如樣品制備。

1.2.5 反相高效液相色譜條件

色譜柱：C 18柱（150 mm×4.6 mm,3.5μm）；流動相A為0.1%TFA水溶液，流動相B為0.1%TFA乙腈溶液，經(jīng)抽濾、超聲脫氣后備用；流速1 m L/min，柱溫40℃，進樣量10μL，檢測波長214 nm；梯度洗脫程序：0～5 min，33～35%B；5～9 min，35～37%B；9～18 min，37～40%B；18～22 min，40～41%B；22～27.5 min，保持 41%B；27.5～28 min，41～43%B；28～36 min，43～45%B；36～45min，保持33%B[15]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將處理后的樣品溶液進行液相色譜分析，每個樣品重復3次，以保留時間定性，外標法定量。根據(jù)樣品中出峰面積大小，計算出不同牛乳中主要蛋白質(zhì)的百分含量[16]，計算結(jié)果見表1。采用SPSS（17.0）軟件對試驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

表1 不同牛乳蛋白的百分含量 %

2 結(jié)果與討論

2.1 不同種類牛乳蛋白質(zhì)電泳分析

圖1 不同胎次牛乳與病牛乳電泳圖

采用SDS-PAGE的方法測定了不同胎次與病牛乳蛋白質(zhì)主要組成及蛋白質(zhì)的相對分子量，結(jié)果如圖1所示。條帶M為蛋白質(zhì)標樣，條帶1、2和3為不同胎次牛乳脫脂乳電泳圖，條帶4和5未知病牛乳和乳房炎牛乳。從電泳圖譜的負極(上)到正極(下)可以顯示9種蛋白(亞基)組分，將其分為上(大分子量)、中(中分子量)和下(小分子量)三組：由圖中可以看出，上端的大分子量組主要為乳鐵蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白(IgG-H)，第3胎牛乳中免疫球蛋白含量高于第1和第2胎牛乳，這與M oore[17]研究一致。乳房炎乳5與病牛乳4在這一區(qū)域條帶較多，且條帶明顯下移，這一區(qū)域分子量范圍在50～70 ku之間；中間的中分子量組為三種酪蛋白(αs-CN、β-CN和κ-CN)，酪蛋白含量高，分子量在20～40 ku之間，主要集中在31 ku左右。除乳房炎乳下移之外，其余差別不大。并且3個胎次牛乳下面有IgG輕鏈。病牛乳沒有；下端的小分子量組主要包括β-乳球蛋白和α-乳白蛋白，僅從分子量看，各胎次牛乳在此區(qū)間差別不大，α-La分子量大約為14 ku，β-Lg分子量大約為18 ku。乳房炎乳條帶較多，各蛋白質(zhì)分子量減小。分析圖譜各牛乳差別的原因，可能是由于乳房炎乳與不同胎次乳由于其蛋白在一級結(jié)構(gòu)上存在不同所致，因而造成蛋白質(zhì)在高級結(jié)構(gòu)、分子量及所帶電荷的不同，最終體現(xiàn)在蛋白的遷移時間的不同。

2.2 不同種類乳蛋白質(zhì)RP-HPLC分析

2.2.1 標品蛋白RP-HPLC分析

分別對5種標準樣品進行蛋白色譜分析，結(jié)果見圖2圖3。在1.2.5色譜條件下，酪蛋白標樣高效液相色譜圖出峰蛋白依次為κ-CN、αs-CN和β-CN，出峰時間大約為6 min、16 min和21 min。乳清蛋白標樣高效液相色譜圖出峰蛋白依次為α-La和β-Lg，出峰時間為24 min和30 min。5種蛋白完全分離，分離效果較好。結(jié)果表明，在該色譜條件下進行乳蛋白單體的分離是可行的。

圖2 牛乳乳清蛋白標準品的HPLC色譜圖

圖3 牛乳酪蛋白標準品的HPLC色譜圖

2.2.2 不同牛乳中樣品中酪蛋白的變化規(guī)律分析

（1）κ-CN的分析。目前發(fā)現(xiàn)κ-CN有11種類型[18]，從圖4可以看出，3個胎次牛乳圖譜中，κ-CN在第1胎牛乳和第2、3胎牛乳圖譜中存在差異。圖5可以看出，病牛乳和乳房炎乳的κ-CN與圖4中存在明顯的差異，顯示其在不同種類牛乳中存在基因多態(tài)型。通過對其峰面積的計算比較其含量結(jié)果見表1，第1胎牛乳中κ-CN含量較高，達到12%，2和3胎牛乳中含量分別為11.6%和10%，呈現(xiàn)減少的趨勢，病牛乳和乳房炎乳的含量分別為6.27%和10.6%，由于其基因類型和含量之間存在差異，因此可能是導致在酸乳和干酪加工中采用酸凝和酶凝時凝固時間和凝塊硬度存在明顯差異的主要原因。

圖4 不同胎次牛乳蛋白質(zhì)組成的HPLC色譜圖

圖5 不同病牛牛乳蛋白質(zhì)組成的HPLC色譜圖

（2）αs-CN的分析。從圖4可以看出，3個胎次牛乳圖譜中，αs-CN在各胎次中基因類型相同，但在圖5中病牛乳與乳房炎乳與圖4中存在明顯差異，可見，當乳牛生病后乳中αs-CN基因出現(xiàn)明顯變化。目前發(fā)現(xiàn)αs1-CN有9種多態(tài)性，αs2-CN有4種多態(tài)性，由于這次試驗只有αs-CN混合標準品，無單獨的αs1-CN和αs2-CN標準品，因此無法對其進行精準的計量，從表1可以看出，第1胎中αs-CN含量占28.5%,第2胎和第3胎中占到44.4%和54.6%，由此可出，隨著產(chǎn)胎次數(shù)增加，酪蛋白中αs-CN所占比例在增大，病牛乳和乳房炎乳的含量分別為30.24%和40.96%，處于中間狀態(tài)。

（3）各樣品中β-CN的分析。從圖4可以看出，β-CN在各胎次中基因多態(tài)性較明顯，圖5顯示兩種病牛乳中β-CN基因類型相近，各種類牛乳蛋白中以單體和雜合體形式出現(xiàn)。從表1可以看出，隨著產(chǎn)胎次數(shù)增加，所占百分數(shù)在逐漸減少，由41.6%降低到32.5%，未知病牛乳中β-CN含量較高，達到40%，而乳房炎乳較低，含量僅有32.2%。

2.2.3 不同牛乳樣品中乳清蛋白的變化規(guī)律

乳清蛋白中，β-Lg的多態(tài)性是最早被發(fā)現(xiàn)的，目前已發(fā)現(xiàn)11種類型[19]，從圖4可以看出，3個胎次牛乳中β-Lg呈現(xiàn)不同的基因形態(tài)，圖5中兩種病牛乳呈現(xiàn)的形態(tài)相同，但與正常牛乳形態(tài)不同。表1可以看出，β-Lg在第1胎次及兩種病牛乳中含量較多，分別為14.7%、23.5%和12.9%。在第2和3胎次中含量較低，達到4.74%和1.6%。從實驗結(jié)果看出，α-La只有1種，未見其多態(tài)性，目前發(fā)現(xiàn)α-La多態(tài)性最低，只有3種，且在病牛乳中未發(fā)現(xiàn)，與電泳結(jié)果有差異。并且α-La在乳蛋白中所占比例最小，最大只有3.28%左右。

3 結(jié)論

乳房炎乳與末知病牛乳與不同胎次牛乳電泳圖譜在乳鐵蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白(IgG-H)這一區(qū)域條帶較多，且條帶明顯下移；中間的中分子量組為三種酪蛋白(αs-CN、β-CN和K-CN)，其含量較高，分子量在20～40 ku之間，主要集中在31 ku左右。除乳房炎乳下移之外，其余差別不大；α-La和β-Lg僅從分子量看，各胎次牛乳在此區(qū)間差別不大，其中α-La分子量大約為14 ku，β-Lg分子量大約為18 ku。乳房炎乳條帶較多，與其它牛乳相比差別較明顯。

通過對不同種類牛乳蛋白色譜分析可知，κ-CN在不同牛乳中存在明顯的差異，隨著胎次增加含量減少，病牛乳和乳房炎乳的含量較低；αs-CN在各胎次中乳蛋白多態(tài)性類型相同，但在病牛乳與乳房炎乳差異明顯，隨著產(chǎn)胎次數(shù)增加，αs-CN所占比例在增大，病牛乳和乳房炎乳的含量分別為30.24%和40.96%，處于中間狀態(tài)；β-CN在各胎次中乳蛋白多態(tài)性較明顯，隨著產(chǎn)胎次數(shù)增加，所占百分數(shù)在逐漸減少，兩種病牛乳中β-CN基因類型相近，含量居中；α-La未見其多態(tài)性，且在乳蛋白中所占比例最小，并且在未知病牛中未檢測到；3個胎次牛乳中β-Lg呈現(xiàn)不同的基因形態(tài)，兩種病牛乳呈現(xiàn)的形態(tài)相同，但與正常牛乳形態(tài)不同。在第1胎次及兩種不同病牛乳中含量較多，在第2和3胎次中含量較低。