除翳解毒方對復(fù)發(fā)單純皰疹病毒性角膜炎大鼠模型血清CD4+、CD8+T細(xì)胞的影響

程 娟，李 琦，張 紅，宋宙光，王 麗，李翠紅，夏靜萍，任麗紅

單純皰疹性病毒性角膜炎 （herpessimplex keratitis,HSK）由單純皰疹病毒 （herpes simplex virus,HSV）感染，免疫與炎癥反應(yīng)參與，損傷角膜及眼表組織結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性眼病[1]。由于抗生素和皮質(zhì)類激素的不合理應(yīng)用，其發(fā)病率有上升趨勢。HSK為最常見的角膜病，在角膜病中致盲率占第一位。病情反復(fù)發(fā)作是此病的特點(diǎn)，且多次發(fā)作后會出現(xiàn)角膜混濁逐漸加重，最終導(dǎo)致失明[2]。

當(dāng)機(jī)體免疫力下降時，潛伏的病毒激活，沿三叉神經(jīng)逆行至靶組織，引起發(fā)病。西藥治療該病雖然有一定療效，但長期應(yīng)用容易產(chǎn)生抗藥性；另外，滴眼液中防腐劑對眼表長期的刺激會影響淚膜功能，導(dǎo)致淚液相對缺失，使角膜失潤抵御功能下降，故本病病程長、易復(fù)發(fā)。中藥抗病毒的優(yōu)越性在于：辨證用藥，隨癥加減，調(diào)節(jié)全身，綜合治療；中藥抑制殺滅病毒作用強(qiáng)，不產(chǎn)生耐藥性，且不易復(fù)發(fā)[3]。筆者采用除翳解毒方治療HSK，經(jīng)過長期臨床研究發(fā)現(xiàn)，除翳解毒方不僅能縮短病程，促進(jìn)疾病痊愈，而且可以減少復(fù)發(fā)率。為進(jìn)一步探討該方抗HSK復(fù)發(fā)的免疫學(xué)機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)使用該方干預(yù)復(fù)發(fā)HSK大鼠模型，觀察其對血清CD4+、CD8+T細(xì)胞及其比值的影響，從細(xì)胞免疫水平探討除翳解毒方對HSK的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動物：選用SPF級SD大鼠80只，雌雄各半，體重250～260 g，裂隙燈顯微鏡、眼底鏡檢查均無異常，山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK(晉)2013-0002。 實(shí)驗(yàn)室溫度 20℃，濕度 50°，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。

1.1.2 主要藥品及試劑：更昔洛韋眼用凝膠（湖北科益藥業(yè)股份有限公司），生產(chǎn)批號：H20050406；除翳解毒方：黃芪、金銀花各15 g、連翹、蒲公英、赤芍、生地黃、黃芩、秦皮、板藍(lán)根、木賊、蟬蛻、谷精草各10 g，由山西省眼科醫(yī)院藥劑科提供；熒光素鈉注射液（廣州白云山明興制藥有限公司），批號：120602；HSV-1毒株 （由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)病毒研究所提供），由山西省疾病預(yù)防控制中心復(fù)制擴(kuò)增病毒，分裝凍存管后保存于-70℃冰箱備用；DAB顯色劑（上海源葉生物工程有限公司）；CD4/CD8檢測試劑盒 （貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司）；單純皰疹病毒1型（HSV-1）核酸檢測試劑盒(熒光PCR法，碩世生物科技股份有限公司)。

1.1.3 主要儀器設(shè)備：YZ5FI數(shù)碼裂隙燈（蘇州六六視覺科技股份有限公司）；DYY-6 PCR電泳儀（北京市 六 一 儀 器 廠 ）；Beckman-coulter，cytomic FC 7500(USA)流式細(xì)胞儀；SJC-Ⅱ型紫外線燈（北京市海淀空后高溫復(fù)合材料廠）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組：將80只SD大鼠，隨機(jī)分為正常組、模型組、中西藥治療組、西藥對照組，每組20只。

1.2.2 HSK原發(fā)感染大鼠模型制備及判定標(biāo)準(zhǔn)：每組大鼠用10%水合氯醛 （0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉，裂隙燈下1 ml注射器針頭在右眼角膜表面行“井”字劃痕，滴加單純皰疹病毒液20μl，閉眼按摩大鼠右眼瞼20 s。造模后1 w內(nèi)每日行裂隙燈檢查、角膜熒光素鈉染色，觀察角膜是否出現(xiàn)病灶，角膜呈現(xiàn)點(diǎn)狀、樹枝狀、地圖狀角膜炎且淚液測試陽性的大鼠被判定為原發(fā)感染模型建立。

1.2.3 病毒分離及鑒定：病毒分離，淚液測試標(biāo)本接種人橫紋肌肉瘤細(xì)胞 （RD）和人喉癌上皮細(xì)胞（Hep-2），置于 36 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱，連續(xù)培養(yǎng) 7 d，逐日觀察并記錄細(xì)胞病變，每份標(biāo)本在2種細(xì)胞上至少傳2代，如不出現(xiàn)致細(xì)胞病變效應(yīng)（Cytopathic Effect，CPE），則判為陰性標(biāo)本；如果出現(xiàn)了皰疹病毒特異的CPE，待CPE達(dá)到+++及以上收集細(xì)胞，提取病毒核酸，按熒光PCR方法進(jìn)一步鑒定，毒株保種。病毒鑒定，采用PCR方法，利用實(shí)時定量PCR儀，使用單純皰疹病毒（HSV）核酸、單純皰疹病毒1型（HSV-1）核酸檢測試劑盒(熒光 PCR法)進(jìn)行檢測，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 干預(yù)方法：選取造模成功大鼠，分為中西藥治療組、西藥對照組、模型組。中西藥治療組給予除翳解毒方灌胃，bid，更昔洛韋眼凝膠，tid，點(diǎn)眼治療；西藥對照組給予更昔洛韋眼凝膠，tid，點(diǎn)眼治療。行裂隙燈顯微鏡檢查、角膜熒光素鈉染色、眼前節(jié)照相，biw，記錄病情變化。

1.2.5 除翳解毒方制備：黃芪、金銀花各15 g、連翹、蒲公英、赤芍、生地黃、黃芩、秦皮、板藍(lán)根、木賊、蟬蛻、谷精草各10 g,一煎加水 910 ml，浸泡 30 min，煮沸后再文火慢煎20 min，二煎加水390 ml，煮沸后，文火慢煎10 min，合并濾液共1000 ml，95℃水浴濃縮至250 mL，濃度為5.2 g/ml，灌胃,按每100 g體重1 ml計算喂藥量，bid，置4℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 復(fù)發(fā)感染大鼠模型制備及判定標(biāo)準(zhǔn)：6 w后自制大鼠固定器，暴露頭部，置于波長為311 nm的紫外線B光下照射大鼠右眼180 s建立復(fù)發(fā)感染模型。每日裂隙燈檢查、角膜熒光素鈉染色觀察角膜是否出現(xiàn)病灶，淚液分泌試紙收集淚液PCR法檢測HSV-1，確定造模是否成功。

1.2.7 觀察 第10 w末，行裂隙燈顯微鏡檢查、眼前節(jié)照相、淚液細(xì)胞培養(yǎng)PCR檢測HSV-I，之后處死全部大鼠，行角膜組織氯化金染色檢測角膜內(nèi)神經(jīng)纖維，流式細(xì)胞儀檢測CD4+、CD8+T細(xì)胞及其比值。（1）角膜神經(jīng)組織氯化金染色觀察，取角膜組織，按以下步驟處理：在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的檸檬酸中放置15 min；置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為l%的氯化金溶液中1 h；置于酸水中5 h(酸水配制為每100 ml蒸餾水加6滴冰醋酸)；乙醇梯度脫水；鋪片、中性樹膠封片。光鏡下觀察，拍照。（2）流式細(xì)胞儀檢測CD4+、CD8+T細(xì)胞、CD4+/CD8+的測定：取大鼠腹主動脈血1 ml測定T淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+T細(xì)胞百分比及CD4+/CD8+的比值，采用單克隆抗體堿性磷酸酶法，選用美國貝克曼公司流式細(xì)胞儀及該公司提供的試劑盒，按說明書要求的操作程序嚴(yán)格操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析，計量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計量資料使用 t檢驗(yàn)，計數(shù)資料使用卡方檢驗(yàn)、方差分析和多個樣本均數(shù)兩兩比較的SNK檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 裂隙燈顯微鏡檢查、眼前節(jié)照相

造模第2、3 d大鼠角膜陸續(xù)開始出現(xiàn)水腫、混濁，角膜熒光素鈉染色呈點(diǎn)狀、地圖狀（見圖1）。

2.2 氯化金染色檢測角膜神經(jīng)纖維

氯化金染色后，光鏡下神經(jīng)纖維和末梢呈黑色。正常組大鼠角膜神經(jīng)纖維豐富，軸突末梢形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)；模型組大鼠角膜周邊纖維束更細(xì)，纖維變稀疏，部分纖維變短，角膜中央失去網(wǎng)絡(luò)狀分布特點(diǎn)；中西藥治療組大鼠角膜周邊及中央神經(jīng)纖維較豐富，軸突末梢大致呈網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；西藥治療組大鼠角膜周邊神經(jīng)束纖維變細(xì)，分支減少（見圖2）。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測CD4+、CD8+，CD4+/CD8+T細(xì)胞

模型組與正常組比較CD4+T細(xì)胞減少，CD8+T細(xì)胞增加，CD4+/CD8+T降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；中西藥組、西藥組與模型組比較CD4+T細(xì)胞增加，CD8+T細(xì)胞減少，CD4+/CD8+T升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；中西藥組與西藥組比較CD4+T細(xì)胞增多，CD8+T細(xì)胞減少，CD4+/CD8+升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

圖1 HSK大鼠模型裂隙燈圖。1A造模前；1B造模后；1C造模后角膜點(diǎn)狀染色圖；1D造模后角膜地圖狀染色。HSK：單純皰疹性病毒性角膜炎

圖2 光鏡下檢測各組氯化金染色角膜神經(jīng)纖維。2A正常組；2B模型組；2C中西藥組；2D西藥組

表1 4 組大鼠 CD4、CD8、CD4/CD8 比較

表1 4 組大鼠 CD4、CD8、CD4/CD8 比較

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與西藥組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

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3 討論

單純皰疹病毒性角膜炎是嚴(yán)重危害視覺健康的眼部感染性疾病，其發(fā)病機(jī)制與免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)紊亂有密切關(guān)系。HSK反復(fù)發(fā)作的原因?yàn)闄C(jī)體抵抗力下降，潛伏在機(jī)體的HSV再次活化并逆行到眼表或角膜的上皮細(xì)胞[4]。Young等[5]報道初次感染HSV患者l、5、10、20 年復(fù)發(fā)率分別為 27%、50%、57%、63%，有復(fù)發(fā)史者復(fù)發(fā)率則更高。雖然西藥如阿昔洛韋、更昔洛韋滴眼液，更昔洛韋膠囊、干擾素、聚肌胞注射液等在抗病毒方面療效肯定，但是在調(diào)節(jié)免疫功能和預(yù)防HSK復(fù)發(fā)方面效果卻不盡人意。

CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在控制HSK的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，缺乏調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可使角膜感染加重，且低劑量的病毒即可致病。CD8+T細(xì)胞雖然在HSK的免疫應(yīng)答中并不占主導(dǎo)地位，但在CD4+T細(xì)胞缺乏時，HSV可刺激CD8+T細(xì)胞起到短暫的免疫反應(yīng)替代作用[6]。CD4+T細(xì)胞減少導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞免疫功能和抗病毒能力降低。CD8+T細(xì)胞具有抑制體液免疫以及抗病毒等免疫功能，血中CD8+T細(xì)胞水平升高意味著抑制性T細(xì)胞和殺傷性T細(xì)胞的平衡失調(diào)，也是導(dǎo)致HSK發(fā)生和復(fù)發(fā)的原因之一。CD4+/CD8+值在一定程度上反映了機(jī)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)[7]。

該病歸屬于《證治準(zhǔn)繩·雜病·七竅門》中“聚星障”及“花翳白陷”的范疇。書中認(rèn)為毒“入里化熱、外邪犯目”所致“肝經(jīng)伏火，復(fù)受風(fēng)邪，上攻黑睛”[8]。陳子燕等[9]指出本病的病因?yàn)榉皟?nèi)傷，病機(jī)為氣虛邪留，邪熱內(nèi)伏，治療上以益氣解毒為主。臨床實(shí)驗(yàn)證明多種益氣驅(qū)邪類中藥均為免疫促進(jìn)劑，能增強(qiáng)單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬功能，誘生干擾素，促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，提高淋巴細(xì)胞免疫水平[10]。

HSK系機(jī)體正虛的基礎(chǔ)上，風(fēng)熱邪毒乘襲，聚積于目，上擾風(fēng)輪而致黑睛云翳，畏光流淚等，久則氣虛漸甚，邪熱內(nèi)伏，演變?yōu)檎撔皯伲磸?fù)發(fā)作，常伴體虛乏力。運(yùn)用益氣解毒類中藥既可以提高病毒性角膜炎的臨床療效，又可以避免耐藥性的產(chǎn)生，同時還能積極防止疾病復(fù)發(fā)，多種功效相集，具有一定的臨床意義。

通過對中醫(yī)文獻(xiàn)的研究及臨床實(shí)踐，以益氣養(yǎng)陰、退翳明目為法，筆者自擬除翳解毒方經(jīng)過長期的臨床觀察，證實(shí)能減輕角膜病損，縮短病程，降低復(fù)發(fā)率，其作用在于既能清熱解毒以祛邪治標(biāo)，又能益氣固表以扶本護(hù)目。方中黃芪、生地黃益氣養(yǎng)陰、扶正固表；金銀花、連翹祛風(fēng)清熱；蒲公英、板藍(lán)根、黃芩、秦皮清熱燥濕解毒、木賊、蟬蛻、谷精草疏散風(fēng)熱、明目退翳共為臣藥；赤芍清瀉肝火、瀉血分郁熱，增強(qiáng)了本方清熱解毒的功效，諸藥合用，融攻補(bǔ)為一方，共奏益氣養(yǎng)陰、疏風(fēng)清熱、退翳明目之功。臨床用除翳解毒方祛邪與扶正同施，標(biāo)本兼治，對防止該病復(fù)發(fā)有較好的療效，充分體現(xiàn)了中醫(yī)藥“祛邪扶正”防治HSK復(fù)發(fā)的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明應(yīng)用除翳解毒方能夠明顯增加CD4+T細(xì)胞數(shù)量，提高CD4+/CD8+比值，并在一定程度上減少CD8+T細(xì)胞數(shù)量，故認(rèn)為除翳解毒方對復(fù)發(fā)性HSK大鼠模型引起的免疫紊亂有糾正作用，能夠加快大鼠免疫功能的恢復(fù)，從而增強(qiáng)機(jī)體抵抗病毒入侵或抑制潛伏病毒活化、復(fù)制的能力，促進(jìn)疾病愈合，這可能是除翳解毒方預(yù)防復(fù)發(fā)的機(jī)制之一。研究結(jié)果也提示在臨床中治療HSK患者，不但應(yīng)重視單純抗病毒藥在急性期達(dá)到臨床痊愈治療目的，更應(yīng)該重視在病程中對全身免疫狀態(tài)的調(diào)節(jié)以及臨床治愈后潛伏期的持續(xù)治療，尤其是增強(qiáng)免疫功能的治療。