清眩潤(rùn)目飲對(duì)蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼模型鼠角結(jié)膜炎癥因子表達(dá)的影響

王佳娣 ，姚 靖 ，曹叢紅 ，于坷鑫

干眼是由于淚液的量或質(zhì)或流體動(dòng)力學(xué)異常引起的淚膜不穩(wěn)定和(或)眼表?yè)p害，從而導(dǎo)致眼不適癥狀及視功能障礙的一類(lèi)疾病[1]。臨床將干眼分為五類(lèi)，以蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型比例最高，60%以上是由瞼板腺功能障礙（MGD）引起，國(guó)內(nèi)資料亦顯示干眼患者中85%以上與MGD有關(guān)[2]，且患病人群呈現(xiàn)出年輕化、低齡化的特點(diǎn)。國(guó)際干眼工作組于2007年明確指出炎癥與干眼的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]，眼表組織的免疫性炎癥是干眼最本質(zhì)的病理生理改變。清眩潤(rùn)目飲主要在臨床上用于治療瞼板腺功能障礙所致蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼,并取得良好療效[4-6]，本實(shí)驗(yàn)旨在觀(guān)察清眩潤(rùn)目飲對(duì)蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼模型鼠角、結(jié)膜炎癥因子表達(dá)的影響，從而探討該藥治療干眼的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選取18只健康SD大鼠（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（黑）2015-003），雌雄不限，體重 20.0±2.0 g/只，經(jīng)裂隙燈檢查眼前節(jié)無(wú)異常，Schirmer試驗(yàn)＞10 mm/5 min且淚膜破裂時(shí)間 （BUT）＞l0 s的動(dòng)物方可使用。隨機(jī)分為3組，分別為空白對(duì)照組6只（12眼），模型組6只 （12眼），清眩潤(rùn)目飲組6只（12眼）?？瞻讓?duì)照組不做任何處理，模型組、清眩潤(rùn)目飲組進(jìn)行造模。

1.2 主要試劑藥品及實(shí)驗(yàn)儀器

清眩潤(rùn)目飲（主要藥物組成：玄參、麥冬、生地黃、金銀花、連翹、防風(fēng)等），中藥按一定比列配伍而成，藥物由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬一院藥劑科提供，并由我校制劑室加工成濃度為每1 ml含生藥1 g的混懸液，密封，4℃保存?zhèn)溆谩?5%乙醇、熒光素鈉試紙（許可證號(hào)：津食藥監(jiān)械生產(chǎn)許20100040）、淚液檢測(cè)濾紙條 （許可證號(hào)：津食藥監(jiān)械生產(chǎn)許2400041）、鹽酸奧布卡因滴眼液 （參天制藥有限公司，5 ml:20 mg）、電子秤、電子天平、眼科手術(shù)顯微鏡（編號(hào)：JX7-130213）、白介素 1β（IL-1β）檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法）（SEA563Ra，優(yōu)爾生公司）、白介素6（IL-6）檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法）（SEA079Ra，優(yōu)爾生公司）、腫瘤壞死因子 α（TNF-α）檢測(cè)試劑盒 （酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法）（SEA133Ra，優(yōu)爾生公司）眼科顯微手術(shù)器械、手持裂隙燈。

1.3 動(dòng)物模型的制作

33%烏拉坦腹腔注射麻醉，給藥劑量為1 g/kg。麻醉滿(mǎn)意后按如下順序進(jìn)行評(píng)分：①瞼緣形態(tài)；②淚膜破裂時(shí)間；③角膜熒光素染色；④Schirmer試驗(yàn)，冷光源下采用改良瞼板腺燒灼法，采用纖維電針改良的燒灼器對(duì)鼠雙眼上下瞼緣所有瞼板腺口逐一燒灼，時(shí)間約為5 s，術(shù)后不使用藥物涂抹鼠結(jié)膜囊，共用7 d，形成蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼模型。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

成功制成干眼模型后，給予清眩潤(rùn)目飲中藥灌胃治療。實(shí)驗(yàn)劑量按照成人劑量，根據(jù)人鼠/兔體表面積等效換算[7]成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物灌胃用藥劑量，qd。模型組用生理鹽水灌胃，qd。連續(xù)灌胃4 w。每2 w測(cè)量體質(zhì)量1次，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥量。

1.5 觀(guān)察指標(biāo)與方法

1.5.1 蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼檢查：術(shù)后第1、2、4 w檢查瞼緣形態(tài)、熒光素染色、Schirmer試驗(yàn)、淚膜破裂時(shí)間。3組動(dòng)物均由同一個(gè)人檢查，每次檢查時(shí)間、地點(diǎn)、照明亮度、濕度及溫度確保相同，檢測(cè)各組模型鼠瞼緣形態(tài)、Schirmer實(shí)驗(yàn)、淚膜破裂時(shí)間(BUT)和熒光素染色。裂隙燈下觀(guān)察模型鼠瞼緣形態(tài)是否規(guī)整、有無(wú)充血、瞼板腺開(kāi)口有無(wú)堵塞、MarX線(xiàn)有無(wú)移位等內(nèi)容。Schirmer實(shí)驗(yàn)[8]：將濾紙條前端5 mm反折成直角，夾在實(shí)驗(yàn)鼠下瞼外側(cè)結(jié)膜囊內(nèi)，5 min后取出濾紙條，2 min后觀(guān)察并記錄濾紙條的濕長(zhǎng)，濾紙濕潤(rùn)長(zhǎng)度＜10 mm/5 min為異常。淚膜破裂時(shí)間[8]：結(jié)膜囊滴入熒光素溶液，使鼠被動(dòng)眨眼數(shù)次，一人固定實(shí)驗(yàn)鼠同時(shí)雙手撐開(kāi)眼瞼，一人在手持裂隙燈鈷藍(lán)光下用寬裂隙光帶觀(guān)察，記錄從最后一次瞬目至角膜出現(xiàn)第一個(gè)黑斑即干燥斑的時(shí)間，BUT＜10 s為異常。角膜熒光素染色：一人固定實(shí)驗(yàn)鼠，一人將熒光素鈉溶液滴入鼠眼結(jié)膜囊內(nèi)，瞬目后，在裂隙燈鈷藍(lán)光下觀(guān)察，觀(guān)察角膜上皮完整性。

1.5.2 標(biāo)本采集及病理分析：給藥4 w后3組實(shí)驗(yàn)鼠均以斷頭法處死，取雙眼角膜、結(jié)膜組織，小部分以4%多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋，經(jīng)過(guò)角、結(jié)膜間斷連續(xù)切片，行HE染色，用光鏡觀(guān)察角、結(jié)膜組織病理學(xué)改變。

1.5.3 角、結(jié)膜炎性因子水平及相關(guān)蛋白含量測(cè)定：按照 TNF-α、IL-1β、IL-6試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟，收集各組實(shí)驗(yàn)鼠眼表組織液，室溫下在相應(yīng)孔中加入相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本，37℃下避光溫育30 min；洗滌5次；在相應(yīng)孔中加入50μl酶標(biāo)試劑，密封避光，37℃下溫育30 min；洗滌5次；每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，避光37℃下顯色15min；每孔加入50μl終止液，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)量各孔吸光度（OD）值，計(jì)算出相應(yīng)兔眼表中 TNF-α、IL-1β、IL-6濃度含量。 利用Western Blot檢測(cè)角、結(jié)膜上皮中TLR4、MyD88蛋白質(zhì)表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠干眼相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)的變化

模型組大鼠BUT較空白對(duì)照組大鼠明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）,說(shuō)明模型復(fù)制成功；清眩潤(rùn)目飲組較模型組BUT延長(zhǎng)，差異性顯著（P=0.000），說(shuō)明清眩潤(rùn)目飲可有效縮短淚膜破裂時(shí)間；清眩潤(rùn)目飲組較空白對(duì)照組（P=0.067），無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組SIT與空白對(duì)照組相比，有顯著性差異（P=0.000），說(shuō)明模型復(fù)制成功；清眩潤(rùn)目飲組與模型組相比，差異性顯著（P=0.000），說(shuō)明清眩潤(rùn)目飲有效果；清眩潤(rùn)目飲組與空白對(duì)照組比較（P=0.075），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？瞻讓?duì)照組角膜熒光素染色評(píng)分與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），說(shuō)明模型復(fù)制成功；清眩潤(rùn)目飲組與模型組比較，角膜熒光素染色評(píng)分降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），說(shuō)明清眩潤(rùn)目飲可減少角膜表面損傷；清眩潤(rùn)目飲組與正常對(duì)照組（P=0.076），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 各組大鼠角膜、結(jié)膜組織病理學(xué)表現(xiàn)

蘇木精-伊紅染色顯示，空白對(duì)照組角膜由2～3層鱗狀上皮細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞排列整齊均勻；結(jié)膜由2～7層非角化鱗狀上皮細(xì)胞組成，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、完整，結(jié)膜表面平滑，可見(jiàn)散在分布的杯狀細(xì)胞。模型組大鼠角膜、結(jié)膜上皮出現(xiàn)缺損，可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，角膜上皮細(xì)胞形態(tài)異常，角膜基質(zhì)層水腫，結(jié)膜上皮杯狀細(xì)胞明顯減少。清眩潤(rùn)目飲組大鼠角膜、結(jié)膜上皮損傷恢復(fù)，細(xì)胞層數(shù)及細(xì)胞形態(tài)接近正常，部分組織仍可見(jiàn)上皮表面不連續(xù)，杯狀細(xì)胞較模型組增多，偶見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(見(jiàn)圖1)。

表1 各組大鼠BUT、Sit及角膜熒光素染色評(píng)分的比較

表1 各組大鼠BUT、Sit及角膜熒光素染色評(píng)分的比較

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

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2.3 各組大鼠結(jié)膜組織炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)量比較

圖1 各組大鼠角膜、結(jié)膜組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)（HE 染色 ×200），空白對(duì)照組大鼠角膜、結(jié)膜上皮完整，散在分布杯狀細(xì)胞；模型對(duì)照組大鼠結(jié)膜上皮缺損，角膜上皮不光滑；清眩潤(rùn)目飲組角膜上皮層基本完整，結(jié)膜上皮細(xì)胞呈增生狀。

IL-1β：模型組大鼠較空白對(duì)照組大鼠數(shù)值明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；清眩潤(rùn)目飲組較模型組IL-1β降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.000）；清眩潤(rùn)目飲組與正常對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.061）。

IL-6：模型組與空白對(duì)照組數(shù)值明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；清眩潤(rùn)目飲組與模型組比較，IL-6的值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；清眩潤(rùn)目飲組與空白對(duì)照組比較（P=0.097），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

TNF-α：模型組與空白對(duì)照組相比數(shù)值明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；清眩潤(rùn)目飲組與模型組比較TNF-α的值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；清眩潤(rùn)目飲組與空白對(duì)照組（P=0.076），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。清眩潤(rùn)目飲可有效降低大鼠結(jié)膜組織中細(xì)胞因子 IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量，與模型組對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），與正常對(duì)照組比較，差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 各組大鼠結(jié)膜組織炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)量比較

表2 各組大鼠結(jié)膜組織炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)量比較

注：**與空白組比較，P＜0.01；##清眩潤(rùn)目飲組與模型組比較，P＜0.01

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2.4 各組大鼠結(jié)膜組織TLR4和MyD88蛋白表達(dá)量比較

TLR4蛋白：模型組大鼠較空白對(duì)照組大鼠數(shù)值明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；清眩潤(rùn)目飲組較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。

MyD88蛋白：模型組與空白對(duì)照組相比數(shù)值明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；清眩潤(rùn)目飲組與模型組比較，MyD88蛋白降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。

表3 各組大鼠結(jié)膜組織中TLR4和MyD88蛋白表達(dá)量的比較

表3 各組大鼠結(jié)膜組織中TLR4和MyD88蛋白表達(dá)量的比較

注：**與空白組比較，P＜0.01；##清眩潤(rùn)目飲組與模型組比較，P＜0.01

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圖3 Western blot法檢測(cè)各組大鼠結(jié)膜組織中炎性因子的表達(dá)

3 討論

自擬湯方“清眩潤(rùn)目飲”以養(yǎng)陰潤(rùn)肺健脾，清熱祛風(fēng)除濕為法應(yīng)用于臨床治療瞼板腺功能障礙致蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼并取得滿(mǎn)意療效[4-6]。 清眩潤(rùn)目飲以增液湯為主方加味而成，增液湯是治療多種陰虛津虧之基礎(chǔ)方。方中玄參，甘苦咸而微寒，入肺經(jīng)，即清熱生津，滋陰潤(rùn)燥，又瀉火涼血，為君藥。生地黃甘苦而寒，清熱養(yǎng)陰，壯水生津，以增玄參滋陰潤(rùn)燥之力；麥冬甘寒、微苦，入肺經(jīng)，具清熱養(yǎng)陰潤(rùn)肺生津之功，滋養(yǎng)肺胃陰津，使水液生化有源，與生地黃共為臣藥。白鮮皮，苦寒，入脾經(jīng)，具有清熱燥濕、祛火解毒、祛風(fēng)止癢之功。金銀花甘寒，連翹味苦，二藥合用共奏疏散風(fēng)熱、清熱解毒之效，且連翹又可消腫散結(jié)，增加君臣藥的清熱作用。防風(fēng)辛甘而溫，入脾經(jīng)，祛風(fēng)止癢之效強(qiáng)，又具升清燥濕止痛之功，四藥合用可有效改善瞼眩赤爛、刺癢等癥狀，共為佐藥。甘草，入脾經(jīng)，補(bǔ)脾益氣，防寒涼之藥太過(guò)傷及脾胃，入肺經(jīng)而潤(rùn)肺可增君、臣藥之功，清熱解毒之功又可助佐藥緩解瞼弦赤爛癥狀，調(diào)和諸藥而為使藥。上藥合用既能養(yǎng)陰生津潤(rùn)肺健脾，又能清熱解毒祛風(fēng)除濕，是治療瞼眩赤爛所致白澀癥的有效方劑。

隨著抗炎治療的廣泛應(yīng)用，通過(guò)現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，很多中藥均具有良好的抗炎作用，且毒副作用小?，F(xiàn)代研究表明增液湯具有增加水液分泌，調(diào)節(jié)免疫炎癥的功效。孫麗英等[9]發(fā)現(xiàn)增液湯能降低干燥綜合征 （SS）模型小鼠血清中TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平，減少炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生。從現(xiàn)代藥理學(xué)研究養(yǎng)陰清熱方清眩潤(rùn)目飲的藥物組成及功效表明：玄參具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)等功效,其有效成份可通過(guò)激活核因子 -κB（NF-κB）通路抑制 IL-1β 及 TNF-α 的表達(dá)[10]，降低炎性因子的濃度。生地黃中的地黃多糖能促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟，下調(diào)由于IL-12和TNF-α生成誘導(dǎo)的泡飲和吞噬作用，增強(qiáng)宿主免疫[11]，生地黃還具有皮質(zhì)激素樣免疫抑制作用[12]。麥冬中提取到的多種類(lèi)型化合物(如皂苷、黃酮、呋喃等)都可從不同途徑抑制炎癥發(fā)展[13]。白鮮皮提取物具有良好的抑菌活性，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有較好的抑制作用[14]。金銀花[15]對(duì)急性炎癥的作用與地塞米松、皮炎平的藥理作用相當(dāng)，可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力，對(duì)感染性疾病具有治療作用。連翹具有免疫調(diào)節(jié)及抗炎作用[16]：其抗炎機(jī)制可能與抑制TNF-α和IL-6這兩種炎癥因子的生成和多成分作用有關(guān)。防風(fēng)有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗過(guò)敏、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[17]。甘草酸苷與多種細(xì)胞表面不同的受體如Toll樣受體2（TLR2）、TLR4結(jié)合，活化下游信號(hào)，如P38MAPK、pJNK 和 NF-κB，上調(diào) TNF-α、IL-1β、IL-6的水平，引起炎癥反應(yīng)[18-19]。

既往研究證實(shí)炎性細(xì)胞因子IL-1，IL-6，TNF-α和β的水平在蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼患者淚液和結(jié)膜上皮中較正常人顯著升高，且與干眼的嚴(yán)重程度相關(guān)，這些因子可作為臨床診斷或療效監(jiān)測(cè)的重要參考指標(biāo)[20]。TLR4是最早發(fā)現(xiàn)且研究最多、最清楚的TLR相關(guān)蛋白，通過(guò)其下游的髓樣分化因子88（MyD88）依賴(lài)性及非依賴(lài)性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路兩個(gè)路徑，NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)炎性介質(zhì)（IL-1α、IL-6、TNF-α、MMPS 等）釋放。 目前已證實(shí)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路直接參與干眼免疫反應(yīng)的啟動(dòng)[21]。干燥環(huán)境、淚液高滲等外界環(huán)境刺激可影響TLR4的活性，激活MAPK與NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路并影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及炎性介質(zhì)的釋放。結(jié)合本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：清眩潤(rùn)目飲可顯著降低蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼模型動(dòng)物淚液中IL-1β、IL-6及TNF-α的含量，這說(shuō)明本方具有良好的抗免疫性炎癥作用。蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型模型鼠的角、結(jié)膜組織中發(fā)現(xiàn)TLR4、MyD88因子亦呈升高趨勢(shì)，服用中藥清眩潤(rùn)目飲后，給藥組TLR4、MyD88因子表達(dá)較模型組顯著降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.000）。實(shí)驗(yàn)病理學(xué)觀(guān)察亦顯示，用藥28 d后，模型組實(shí)驗(yàn)鼠球結(jié)膜炎癥程度最重，清眩潤(rùn)目飲組大鼠角膜、結(jié)膜上皮損傷恢復(fù)，細(xì)胞層數(shù)及細(xì)胞形態(tài)接近正常，部分組織仍可見(jiàn)上皮表面不連續(xù)，杯狀細(xì)胞較模型組增多，偶見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。因此，我們認(rèn)為清眩潤(rùn)目飲及其有效成分在蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼的治療中發(fā)揮作用，基于免疫的非感染性炎癥與干眼的密切關(guān)系，推測(cè)清眩潤(rùn)目飲對(duì)蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼的免疫調(diào)節(jié)作用主要通過(guò)干預(yù)TLR4及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，減少炎性細(xì)胞因子釋放，減緩杯狀細(xì)胞凋亡而發(fā)揮其藥理用。