農(nóng)作物種子檢測中常用電泳方法的比較分析

鄭戈文

（山西省農(nóng)業(yè)種子總站，太原 030006）

種子是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的基本資料，種子質(zhì)量的優(yōu)劣關(guān)系到國計(jì)民生，種子質(zhì)量檢測是把好種子質(zhì)量關(guān)的重要手段。隨著檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，電泳技術(shù)在種子質(zhì)量檢測中發(fā)揮著越來越大的作用。電泳是指在電場作用下，帶電顆粒向與其電性相反電極移動(dòng)的現(xiàn)象。電泳技術(shù)是利用帶電顆粒在電場作用下移動(dòng)速度不同而實(shí)現(xiàn)分離的技術(shù)。在農(nóng)作物種子質(zhì)量檢測中常會(huì)用到4種不同的電泳方法：瓊脂糖凝膠電泳、小板聚丙烯酰胺凝膠電泳、大板聚丙烯酰胺凝膠電泳和毛細(xì)管電泳。不同的電泳方法適合不同的檢測項(xiàng)目，各方法對實(shí)驗(yàn)儀器、檢測技術(shù)水平、實(shí)驗(yàn)室條件和操作人員的要求也不同。

1 四種不同的電泳方法

1.1 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是分子檢測中常用的檢測方法，不同濃度的瓊脂糖凝膠（0.3%～1.5%）可以將200bp～50kb的DNA片段分離。當(dāng)用溴化乙啶（EB，熒光嵌入染料）染色，通過凝膠成像系統(tǒng)，能觀察到發(fā)出熒光的DNA條帶，確定DNA片段在凝膠中的位置及質(zhì)量，或與參照DNA比較，判定被檢基因的有無。瓊脂糖凝膠電泳可以檢出1～10ng的DNA的存在[1]。通常實(shí)驗(yàn)室多用電泳儀和水平槽裝置進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

1.2 小板聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠為支持物的一種電泳。聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（簡稱Bis）聚合成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。由于電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，聚丙烯酰胺凝膠電泳可以將分子大小相同而帶不同數(shù)量電荷或者帶相同數(shù)量電荷而分子大小不同的蛋白質(zhì)、酶或者DNA片段分離開[2]。小板聚丙烯酰胺凝膠通常用電泳儀和小板電泳槽進(jìn)行電泳。

1.3 大板聚丙烯酰胺凝膠電泳大板聚丙烯酰胺凝膠電泳原理同小板聚丙烯酰胺凝膠電泳，只是單體和交聯(lián)劑的比例不同，形成大小不同的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，膠更薄、移動(dòng)距離長，能將小片段DNA（5～500bp）分離開，甚至相差2～5bp的DNA片段也能區(qū)分開。根據(jù)Marker或者參照樣品DNA譜帶的位置，可以估測出被檢樣品DNA片段的大小。大板聚丙烯酰胺凝膠電泳需要高壓電泳儀和大板垂直電泳槽進(jìn)行電泳。

1.4 毛細(xì)管熒光電泳毛細(xì)管熒光電泳是將膠灌在一種空芯的微細(xì)毛細(xì)管中，利用電泳和電滲流的電動(dòng)力學(xué)原理，把PCR產(chǎn)物高效分離，利用熒光檢測到產(chǎn)物信號，通過軟件分析系統(tǒng)轉(zhuǎn)化成峰值圖導(dǎo)出結(jié)果的電泳技術(shù)。毛細(xì)管電泳檢測方法可以將相差1bp的DNA片段分離開，通過不同的峰值圖展示出來，經(jīng)過參照樣品和基準(zhǔn)物質(zhì)的矯正，獲得相對精確的數(shù)據(jù)。在引物上標(biāo)記不同的熒光信號，可以將若干組不同的PCR產(chǎn)物放在同一個(gè)反應(yīng)孔中電泳，根據(jù)熒光信號顏色的不同和PCR產(chǎn)物大小的不同，分析出一個(gè)樣品在不同位點(diǎn)的特性值[3]。毛細(xì)管熒光電泳通常在基因分析儀上進(jìn)行。

2 不同電泳方法適合不同的檢測項(xiàng)目

瓊脂糖凝膠電泳在農(nóng)作物種子質(zhì)量檢測中多用于轉(zhuǎn)基因檢測和DNA質(zhì)量檢測。在轉(zhuǎn)基因檢測中通過分析樣品中目標(biāo)DNA片段的有無與陽性對照基因比較，確定檢測樣品是陽性還是陰性；在分子檢測中用于檢測DNA的質(zhì)量，觀察DNA譜帶的位置、整齊度和亮度來判斷DNA質(zhì)量的好壞。圖1是一個(gè)棉花種子樣品CaMV35S啟動(dòng)子基因的檢測結(jié)果圖。

圖1 棉花種子CaMV35S基因檢測結(jié)果

棉花種子樣品1、2、3檢測出CaMV35S基因，與陽性參照結(jié)果相同，其余樣品均未檢出該基因，試驗(yàn)中陽性參照樣品和Marker條帶清晰，陰性參照和空白對照樣品均無條帶，試驗(yàn)結(jié)果可靠。

小板聚丙烯酰胺凝膠電泳主要用于種子樣品的純度檢測。在電泳圖譜中觀察分析各個(gè)泳道電泳譜帶的差異，判定樣品的純度，或根據(jù)參照樣品的信息估測DNA片段的大小。圖2是一個(gè)玉米種子樣品鹽溶蛋白電泳的結(jié)果圖，該圖顯示，此樣品種子一致性較好，無異品種。

圖2 玉米種子樣品鹽溶蛋白電泳檢測

大板聚丙烯酰胺凝膠電泳主要用于種子樣品SSR分子標(biāo)記真實(shí)性檢測和一致性檢測。根據(jù)不同品種在各個(gè)位點(diǎn)的典型特異譜帶，進(jìn)行樣品之間比較或者與DNA指紋數(shù)據(jù)庫比對，判斷分析種子樣品的一致性和真實(shí)性。圖3是一個(gè)玉米種子樣品SSR分子標(biāo)記方法檢測引物bnlg2291k4大板聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果圖，該圖顯示，這個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)4種不同的特異型譜帶，將20個(gè)不同的玉米雜交種分成4種不同的類型。

圖3 玉米種子樣品大板聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測

毛細(xì)管電泳熒光檢測方法主要用于農(nóng)作物種子的真實(shí)性檢測和一致性檢測。分析軟件導(dǎo)出的峰值圖，進(jìn)行合并與整理，比對指紋數(shù)據(jù)庫的指紋，判定被檢種子樣品的身份信息。圖4是20份玉米種子樣品SSR分子標(biāo)記引物bnlg1671y17毛細(xì)管電泳熒光檢測結(jié)果圖，在這個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)5種不同大小的特異峰，把20個(gè)不同的玉米品種分成5種不同的類型。

圖4 20份玉米種子樣品毛細(xì)管電泳檢測

3 不同電泳方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較

瓊脂糖凝膠電泳檢測可以分離的DNA片段范圍較廣，且能較好地分離長度相差較大的DNA片段，操作簡單，對實(shí)驗(yàn)室條件和操作技術(shù)人員的要求低；但是該方法需要用到EB，即一種高致癌性的強(qiáng)誘變劑，對操作人員和環(huán)境的污染較嚴(yán)重，雖然可以用EB替代物（GoldView、GelRed和 GelGreen、SYBR GreenⅠ），但易受到替代物的染色效果和穩(wěn)定性的影響；另外這種方法的精確度較低，要區(qū)分大小相近的DNA片段比較困難。

小板聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測操作過程中灌膠、點(diǎn)樣、電泳、染色等程序操作相對簡單，對實(shí)驗(yàn)室條件、儀器設(shè)備和技術(shù)人員要求不高，但是該方法的檢測分辨率較低，不能清晰地區(qū)分大小相近的DNA片段。

大板聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測精確度比小板聚丙烯酰胺凝膠電泳高，成本相對較低，但凝膠制備與電泳、染色等操作程序比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，對操作人員技術(shù)要求較高，仍無法讀出譜帶的精確數(shù)據(jù)，只能與參照樣品比較，估測它的大小，實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果的比對誤差較大。

毛細(xì)管電泳熒光檢測方法結(jié)果精確度高，操作簡單，通量高，省時(shí)省力，但是儀器購置、維護(hù)、熒光引物、耗材等試驗(yàn)成本較高；并要求儀器處于適合的溫度條件下，供給穩(wěn)定的電源，實(shí)驗(yàn)室有一定的潔凈度以及有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員，以保證儀器的正常運(yùn)行，確保檢測數(shù)據(jù)的結(jié)果準(zhǔn)確。

4 小結(jié)

在種子質(zhì)量檢測中，不同的檢測項(xiàng)目選擇不同的電泳方法。瓊脂糖凝膠電泳是一種理想的檢測被檢基因有無和檢測DNA質(zhì)量的方法；小板聚丙烯酰胺凝膠電泳能區(qū)分親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的品種，但由于近年來品種間親緣關(guān)系越來越近，該方法的應(yīng)用率也在逐年降低；大板聚丙烯酰胺凝膠電泳是目前種子樣品純度檢測和真實(shí)性檢測中較常用的檢測方法，成本相對較低；毛細(xì)管電泳熒光檢測是種子檢測中精確度較高的一種技術(shù)，但檢測成本較高，推薦有一定經(jīng)濟(jì)實(shí)力的實(shí)驗(yàn)室使用。隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，試驗(yàn)成本的降低，毛細(xì)管電泳熒光檢測方法是一種自動(dòng)化程度較高、試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠、人們較信賴的檢測方法。