江蘇油田污水處理系統(tǒng)中微生物群落結構及分布特征研究

吳偉林，楊 帆，孟章進，姜桂英，方 芝

（江蘇油田石油工程技術研究院，江蘇揚州 225009）

油田經長期注水開發(fā)，地層水中已形成了較為穩(wěn)定的微生物群落，在低于100℃的較淺的地層中，微生物群落較為復雜，種類多且數(shù)量大，以細菌為主，主要包括石油烴降解菌、脫氮菌、產甲烷菌、硫酸鹽還原菌、鐵細菌、硫細菌和腐生菌等。這些細菌在地層環(huán)境長期生存的過程中，產生了較強的適應性[1]。這些微生物的存在對水質有很大影響，在油田水系統(tǒng)中尤以硫酸鹽還原菌（SRB）、鐵細菌（FB）和腐生菌（TGB）對水質的影響最大。

傳統(tǒng)的富集培育、分離鑒定的生物學方法，只能獲得生物的可培養(yǎng)部分，而這可培養(yǎng)部分僅占環(huán)境生物的百分之幾，不同的生物還需要準備不同的培養(yǎng)基進行選擇性培養(yǎng)[2]。用分子生態(tài)學研究方法可以更全面認識環(huán)境中的生物，從環(huán)境中提取總的生物分子DNA，利用PCR（聚合酶鏈式反應）技術，在特定引物作用下，將環(huán)境中存在的生物信息分子16S rDNA進行2n倍擴增（n=30～40），這些分子經過連接到質粒上轉化進入感受態(tài)細胞中，培養(yǎng)、選取連接轉換成功的細胞，并提取其中的生物信息分子16S rDNA，對其進行測序，再與基因庫中的生物信息分子16S rDNA進行對比，確定科屬或種屬，即構建成環(huán)境樣品的基因文庫[3-7]。這種方法較費時，但對研究環(huán)境中存在的物種非常有用。另一種簡便快速的生物技術方法是DGGE（變性梯度凝膠電泳），雖然得不到非常詳盡的物種信息，但可以快速檢測到生物的變化，對物種的部分信息也能有所了解。

本文用基因文庫法對兩個污水處理大站系統(tǒng)中的菌群進行普查，建立江蘇油田回注污水的菌群基因組文庫，并應用DGGE技術分析系統(tǒng)流程中細菌群落結構變化，為后續(xù)污水治理提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和儀器

高二聯(lián)和楊家壩污水處理站系統(tǒng)水樣；離心機；PCR擴增儀；變性梯度凝膠電泳儀。

1.2 實驗方法

總DNA提取：將油田采集的樣品搖勻，取1200mL～2 000 mL樣品于離心杯中，5 000 r/min離心20 min，小心移除上清液。依次加入溶菌酶、氯仿處理，離心獲得樣品的總DNA。

PCR擴增：所得細菌總DNA，PCR擴增16S rDNA，瓊脂糖電泳檢測確認，加入特征引物PCR擴增16S rDNA V3區(qū)。

功能菌的選擇性培養(yǎng)：根據(jù)油田腐蝕重要菌的特性，利用選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)腐生菌、鐵細菌及硫酸鹽還原菌，提取其總DNA擴增16S rDNA中的V3區(qū)，同樣進行DGGE分析，對照其他樣品，確定相關細菌，軟件測定各條帶亮度，分析總生物量和重要細菌的相對量。

2 結果與討論

2.1 油田水樣的DGGE測定結果

圖1 高二聯(lián)和楊家壩污水處理站系統(tǒng)中細菌群落及分類菌DGGE

對采集的高二聯(lián)和楊家壩區(qū)塊12個樣品，通過總DNA的提取，細菌群落的16S rDNA V3區(qū)選擇性擴增，并進行DGGE檢測，其結果（見圖1，左圖），并與選擇性培養(yǎng)后的結果對比（見圖1，右圖）。從圖1中可以看出各樣品呈現(xiàn)不同的細菌分布特征，主體微生物較接近。其中樣品3、4號細菌種類最豐富。3及4號合并建庫。

2.2 污水處理系統(tǒng)中細菌分布特征

根據(jù)水樣的細菌豐富情況，選擇3號和4號水樣合并構建細菌文庫。由樣品的總DNA通過連接和轉化，構建了相應的文庫，結果（見表1）。

由表1可知，樣本中存在大量未培養(yǎng)的細菌，也存在 Geobacter lovleyi SZ，Desulfobulbus sp，Bacterium B1C2-1，Arcobacter sp.R-28214， 油田細菌，Pseudomonas stutzeri A1501，Bacteroides sp，Acholeplasma sp，Syntrophobacter sulfatireducens，Desulfobulbus propionicus，Desulforegula conservatrix，Wolinella succinogenes，F(xiàn)irmicutes bacterium 及 Trichlorobacter thiogenes等。主要的硫酸鹽還原菌為Desulfobulbus和Desulforegula。

表1 江蘇油田采集樣品3號和4號水樣的細菌文庫

表1 江蘇油田采集樣品3號和4號水樣的細菌文庫（續(xù)表）

其相對豐度（見表2）。

從表2可以看出，油田中以未培養(yǎng)的細菌為主，占總體的近40%，其次是羅氏地細菌和硫酸鹽還原菌分別約占16%，假單胞菌約占7%，端細菌及琥珀菌分別約占5%，其他如細菌，共生菌，三氯菌及鹽沼菌等各約占2%。根據(jù)油田功能菌（腐生菌、硫酸鹽還原菌及鐵細菌）分，腐生菌約占44%，硫酸鹽還原菌約占16%，鐵細菌＜2%，未培養(yǎng)其生理生化特性不明的微生物占40%。

根據(jù)文庫的細菌檢測到的豐度及DGGE條帶亮度的聯(lián)系，利用凝膠分析系統(tǒng)進行半定量，分析兩個污水處理系統(tǒng)中細菌量及群落變化或分布，結果（見表3，表 4）。

高集污水系統(tǒng)中油井微生物較多，處理后逐步降低，注水井中微生物又高了；假單胞菌油井中較多，處理后降低至消失；未培養(yǎng)菌及硫酸鹽還原菌為主體。油井中高6-58的硫酸鹽還原菌（細菌量指數(shù)1 203）較高6-65的硫酸鹽還原菌（細菌量指數(shù)700）高；地細菌油井中僅在高6-58存在，處理流程中逐步減少；端細菌在油井高6-65中較高，流程中僅在高二聯(lián)60 m3緩沖罐出口檢測到；沃氏琥珀菌僅在油井高6-58中檢測到；處理流程中高二聯(lián)三相分離器出口硫酸鹽還原菌（細菌量指數(shù)2 161）最高，依次減少緩沖罐出口硫酸鹽還原菌（細菌量指數(shù)1 337），高二聯(lián)注水泵進口硫酸鹽還原菌（細菌量指數(shù)1 353）。

楊家壩污水處理系統(tǒng)中，處理流程中細菌量較高，隨處理過程而減少，種類較少，仍然以未培養(yǎng)菌及硫酸鹽還原菌為主體。該系統(tǒng)中，假單胞菌、地細菌、端細菌及沃氏琥珀菌幾乎沒有，僅在楊家壩注水泵進口檢測到不足10%的地細菌。

油井中硫酸鹽不同，卞東中轉站硫酸鹽還原菌（細菌量指數(shù)3 598），郭塘中轉站硫酸鹽還原菌（細菌量指數(shù)1 544），閔18中轉站硫酸鹽還原菌（細菌量指數(shù)3 150），處理流程依次增加，楊三相分離器出口（硫酸鹽還原菌細菌量指數(shù)3 567），高100 m3沉降罐出口（硫酸鹽還原菌細菌量指數(shù)4 681），楊家壩注水泵進口（硫酸鹽還原菌細菌量指數(shù)4 737）。

表2 檢測到的細菌相對豐度

表3 高集污水處理系統(tǒng)細菌群落分布

表4 楊家壩污水處理系統(tǒng)細菌群落分布

按油田功能分類細菌的結果（見表5）。

由表5可知，高集和楊家壩區(qū)塊污水中以腐生菌為主，其次是硫酸鹽還原菌，鐵細菌相對較少。值得注意的是，在卞東中轉站水樣中鐵細菌較多，硫酸鹽還原菌未檢測到；高6-65水樣中，鐵細菌較硫酸鹽還原菌多。

3 結論

（1）用基因文庫法對高二聯(lián)和楊家壩污水處理站系統(tǒng)中菌群進行普查，建立了回注污水的菌群基因組文庫，發(fā)現(xiàn)水樣中以未培養(yǎng)的細菌為主，占總體的近40%，其次是羅氏地細菌和硫酸鹽還原菌分別約占16%，假單胞菌約占7%，端細菌及琥珀菌分別約占5%，其他如細菌，共生菌，三氯菌及鹽沼菌等各占約2%。根據(jù)油田功能菌（腐生菌、硫酸鹽還原菌及鐵細菌）分，腐生菌占約44%，硫酸鹽還原菌占約16%，鐵細菌占＜2%，未培養(yǎng)其生理生化特性不明的微生物占40%。

（2）通過DGGE分析發(fā)現(xiàn)，高二聯(lián)集輸系統(tǒng)中鐵細菌增加，而SRB減少。楊家壩集輸系統(tǒng)中，鐵細菌和SRB均增加。鐵細菌在高二聯(lián)集輸系統(tǒng)中比楊家壩集輸系統(tǒng)中多，而SRB在楊家壩集輸系統(tǒng)中比高二聯(lián)集輸系統(tǒng)多。

表5 油田水系統(tǒng)中分類菌的分布情況

（3）通過基因文庫法和DGGE技術對污水處理站系統(tǒng)中菌群分析，有利于了解污水處理系統(tǒng)中細菌種類和分布情況，特別是油田常見危害菌（SRB、TGB、FB）的分布，為后續(xù)治理細菌起到指導作用。