拳參總黃酮體外抑菌作用的初步研究*

王桂玲 費洪榮 趙雪梅 趙 瑩

(泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271016)

拳參為蓼科蓼屬植物拳參(Polygonum bistorta L.)的根莖,別名紫參、山蝦、草河車等，主要分布在吉林、河北、山東、湖北、陜西等地。苦、澀，性寒，具有清熱解毒、止血、消腫等功效，用于治療赤痢、熱瀉、肺熱咳嗽、癰腫、痔瘡出血、蛇蟲咬傷等。拳參根莖中含有多種化學(xué)成分如：黃酮類、萜類、醌類、多糖、粘液質(zhì)、樹脂等。近年來有許多文獻(xiàn)報道了蓼科蓼屬植物在抗腫瘤、抗氧化、止痛、抗菌、抗炎等方面的應(yīng)用[1-4]。本研究是以拳參中總黃酮作為研究對象，先采用乙醇回流提取拳參中總黃酮，HPD-400型大孔吸附樹脂進(jìn)行純化，對得到的粗品及精品通過Kirby-Baue紙片擴(kuò)散法研究對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑制效果，并采用二倍稀釋法測定了最低抑菌濃度(MIC)。本研究為拳參藥理作用的進(jìn)一步開發(fā)提供了實驗依據(jù)，同時也為拳參資源進(jìn)一步開發(fā)和利用提供了參考。

1 儀器與試劑

1.1儀器

RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；MPZ1002電子天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司)；FDU-1200冷凍干燥機(jī)(上海愛朗儀器有限公司)；島津UV-2500紫外-可見分光光度計(島津國際貿(mào)易(上海)有限公司)；TMQ.R-3250自動臺式滅菌器(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司)；KQ-500DE 數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SW-CJ-2F超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；HHB11電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津市實驗儀器廠)。

1.2材料和試劑

拳參(濟(jì)南藥業(yè)集團(tuán)中藥飲片廠)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(天津一方科技有限公司)；HPD-400型大孔吸附樹脂(河北滄州寶恩化工有限公司)；菌株：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌(泰山醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實驗室提供)；DMSO(分析純)(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)；其他試劑均為分析純。

2 實驗方法

2.1溶液配制

2.1.1標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品1 mg，甲醇溶解，定容至10 ml容量瓶中，配成質(zhì)量濃度為0.1 mg/ml的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，保存，備用。

2.1.2AlCl3溶液的制備 稱取AlCl325 g，甲醇溶解，定容至250 ml容量瓶中，配成10%AlCl3溶液，保存，備用。

2.1.3樣品的制備 準(zhǔn)確稱取拳參40 g，按最佳工藝條件[5]提取，10倍量55%乙醇回流提取3次，每次1 h，合并提取液，回收乙醇，水溶液部分用石油醚萃取2次，萃取后的溶液分成2份，一份溶液采用冷凍干燥，制成粗粉，即粗品。另外一份溶液用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH為3的上柱液，然后以流速1 ml·min-1上預(yù)處理的HPD-400型大孔吸附樹脂柱，吸附完全后，先以蒸餾水洗脫至無色，再用55%乙醇洗脫[6]，收集洗脫液，回收乙醇，水溶液部分進(jìn)行冷凍干燥，制成粗粉，即精品。

2.2含量測定

2.2.1確定最大吸收波長 精密吸取“2.1.1”項蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5 ml，置于10 ml比色管中，加甲醇至1 ml，再加10%的AlCl3溶液2 ml，搖勻，放置10 min，在紫外分光光度儀上200～800 nm區(qū)間掃描，確定最大吸收波長為415 nm。

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取“2.1.1”項蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0 ml、0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml，分別置于10 ml比色管中，各加甲醇至1 ml，再分別加入10%的AlCl3溶液2 ml，搖勻，放置10 min，在415 nm波長處測定吸光度，平行測定3次求平均值，以質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)線性回歸，得回歸方程：A=13.656C+0.0404，R2=0.9969，表明蘆丁溶液在0.02～0.1 mg/ml線性關(guān)系良好。

2.2.3樣品含量的測定 準(zhǔn)確稱取拳參總黃酮粗品及精品各10 mg，甲醇定容至10 ml容量瓶中，分別用移液管移取1 ml，置10 ml比色管中，各加入10%的AlCl3溶液2 ml，搖勻，放置10 min，在415 nm波長處測定吸光度，代入“2.2.2”項標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算黃酮的含量。

3 抑菌實驗

3.1菌懸液的制備

在潔凈工作臺上，將供試菌株(金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、大腸桿菌Escherichia coli)接入試管斜面培養(yǎng)基上。然后置于(35±1)℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 18～24 h，將供試菌株活化，再用滅菌的生理鹽水配制濃度為107～108cfu·ml-1的菌懸液，備用。

3.2藥敏片的制備

取定性濾紙，用打孔機(jī)打成6 mm直徑的圓形小紙片，將濾紙片放入清潔干燥的培養(yǎng)皿中，高壓消毒滅菌后，備用。

3.3總黃酮粗品及精品溶液的制備

分別稱取拳參總黃酮粗品及精品適量，各置于1.5 mlEP管中，各加入1 mlDMSO，超聲溶解，整個操作過程嚴(yán)格無菌。

3.4總黃酮粗品及精品的抑菌活性測定

采用Kirby-Baue紙片擴(kuò)散法：在無菌潔凈工作臺上，用涂抹法將各供試菌液接種在培養(yǎng)基上，制成含菌平板。用無菌鑷子夾取濾紙片浸泡在總黃酮粗品及精品及DMSO溶液中，然后夾取濾紙片放入培養(yǎng)皿中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，空白對照為DMSO，觀察紙片周圍有無抑菌圈，并測量抑菌圈的直徑，以抑菌圈直徑d大小進(jìn)行判斷(d>6 mm表示有抑菌作用；d≤6 mm表示無抑菌作用；6 mm15 mm 表示高度敏感)，陰性對照組應(yīng)無抑菌圈產(chǎn)生。以此來評價抑菌效果，結(jié)果如表1所示。

表1 拳參總黃酮粗品及精品對供試菌的抑菌圈直徑

由表1可以看出，拳參總黃酮的粗品及精品對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有一定的抑制作用，根據(jù)抑菌圈直徑判斷，總黃酮精品對2種菌抑制作用明顯，屬于高度敏感，總黃酮粗品對2種菌抑制作用屬于中度敏感。

3.5總黃酮粗品及精品最低抑菌濃度(MIC)的測定

稱取拳參總黃酮粗品及精品溶液按二倍稀釋法稀釋成各種濃度，方法為各取滅菌EP管14支，各按照1至14編號。首先向管中各加入500 μl的DMSO，加500 μl的藥液于第1管中，混勻，從1號管中吸取500 μl溶液放入2號管，混勻，接著從2號管中吸取500 μl溶液放入3號管，依次逐管稀釋到第13管，第14管加入DMSO做空白對照。用無菌鑷子夾取濾紙片在各管溶液中進(jìn)行浸泡，然后夾取濾紙片放入已接種菌液的培養(yǎng)皿中，DMSO為空白對照，放于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，觀察紙片周圍有無抑菌圈，并測量抑菌圈的直徑。以能抑制細(xì)菌生長的最低濃度為拳參總黃酮對該細(xì)菌的最低抑菌濃度(MIC)。結(jié)果如表2、3所示，圖1～4所示。

表2 拳參總黃酮精品對供試菌的最低抑菌濃度

由表2可以看出，拳參總黃酮精品對2種菌都有較強(qiáng)的抑制作用，MIC 值分別為：金黃色葡萄球菌為0.08257 mg/ml，大腸桿菌為0.08257 mg/ml。

表3 拳參總黃酮粗品對供試菌的最低抑菌濃度

由表3可以看出，拳參總黃酮粗品對2種菌也有一定的抑制作用，MIC值分別為：金黃色葡萄球菌為0.2815 mg/ml，大腸桿菌為0.2815 mg/ml。

圖1 拳參總黃酮精品抑制金黃色葡萄球菌效果照片

圖2 拳參總黃酮精品抑制大腸桿菌的效果照片 (圖中9號為空白對照， 5、6、7、8為總黃酮精品稀釋的不同濃度)

圖3 拳參總黃酮粗品抑制金黃色葡萄球菌的效果照片

圖4 拳參總黃酮粗品抑制大腸桿菌的效果照片 (圖中1、2、3、4為總黃酮粗品稀釋的不同濃度)

4 討論及結(jié)論

4.1抑菌實驗研究表明，拳參總黃酮粗品及精品對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有一定的抑制作用。總黃酮精品對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的最低抑菌濃度分別為0.08257 mg/ml、0.08257 mg/ml；總黃酮粗品對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的最低抑菌濃度分別為0.2815 mg/ ml、0.2815 mg/ml。

4.2拳參作為常用的中草藥，在我國分布廣泛，資源豐富，價格低廉，且含有多種活性成分，其含有的成分具有毒副作用小，不易產(chǎn)生耐藥性的特點，實驗結(jié)果表明拳參總黃酮在抗菌方面具有廣泛的應(yīng)用潛力，有良好的應(yīng)用前景。本研究為拳參藥理作用的進(jìn)一步開發(fā)提供了實驗依據(jù)，同時也為拳參資源進(jìn)一步開發(fā)和利用提供了參考。