響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取黑枸杞色素

馮小雨，蔡 瑜，燕雪瑩，張雅潔，張 嵐

(吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院,吉林 吉林 132013)

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)是茄科枸杞屬多年生灌木植物，藏藥稱“旁瑪”，是中國(guó)西北地區(qū)的一種珍貴植物資源。果實(shí)中含有大量的活性物質(zhì)，其中黑枸杞色素是主要活性物質(zhì)之一。該物質(zhì)溶于水中，具有較強(qiáng)的浸染能力和良好的耐熱、耐光、耐酸能力，是一種優(yōu)良的天然色素資源[1-2]。黑枸杞具有抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤、延緩衰老、增強(qiáng)免疫力等功效，因此在食品、醫(yī)藥等方面日益受到重視，極具研究和開(kāi)發(fā)價(jià)值。

目前常用的色素提取方法包括溶劑、超聲、振蕩和微波提取法。黑果枸杞色素的提取方式主要是溶劑提取法，且可供參考文獻(xiàn)較多。然而，該方法雖然操作簡(jiǎn)單、對(duì)設(shè)備要求較低，但存在提取效率較低、雜質(zhì)含量高、提取時(shí)間長(zhǎng)、熱不穩(wěn)定、成分易被破壞等缺點(diǎn)[3-5]，故應(yīng)與輔助提取方法相結(jié)合，以改進(jìn)提取效果。但目前輔助提取黑果枸杞色素的相關(guān)研究相對(duì)較少，故本課題利用超聲輔助技術(shù)對(duì)黑果枸杞色素進(jìn)行提取，結(jié)合響應(yīng)曲面分析，優(yōu)化提取工藝條件，以期為黑果枸杞色素的研究及利用提供一些參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

黑果枸杞由青海諾木洪黑枸杞農(nóng)場(chǎng)提供。

FA1104N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，AF-20A型密封式粉碎機(jī)(溫陵市奧麗中藥器械有限公司)，722型可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海菁華科技有限公司)，KQ-100DB型數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 黑果枸杞色素提取和測(cè)定

將黑果枸杞放置于50 ℃恒溫干燥箱內(nèi)烘干，用粉碎機(jī)粉碎成粉末并過(guò)80目篩，黑果枸杞干粉，加入乙醇超聲浸提，過(guò)濾，在545 nm處測(cè)吸光度值。

1.3 黑果枸杞色素提取Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)對(duì)可能影響黑果枸杞色素吸光度值的參數(shù)，包括超聲溫度(t1)、料液比(t2)、乙醇濃度(t3)、超聲時(shí)間(t4)、超聲功率(t5)進(jìn)行主效應(yīng)分析，選用N=5的PB設(shè)計(jì)，每個(gè)因素取高(+1)和低(-1)兩個(gè)水平，以吸光度值為指標(biāo)，篩選出主要的三個(gè)因素。PB試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表 1 PB試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表

1.4 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果，確定3個(gè)顯著的因素，確定爬坡的方向，選擇合理的步長(zhǎng)，設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)的最佳路徑。

1.5 黑果枸杞色素提取Box-Behnken Design優(yōu)化設(shè)計(jì)

在PB試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選擇超聲溫度(A)、料液比(B)、乙醇濃度(C)為因素，采用Box-Behnken Design的設(shè)計(jì)方案，因素水平表見(jiàn)表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 Placket-Burman試驗(yàn)結(jié)果

黑果枸杞Placket-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)及結(jié)果如表3。通過(guò)效應(yīng)值的計(jì)算，利用Minitab17軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行因子分析,t檢驗(yàn)得到回歸方程為：

A=0.493 75-0.029 92×t1+0.050 08×t2+

0.035 08×t3-0.007 92×t4+0.011 75×t5

PB實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果見(jiàn)表4。其S=0.027 077 6,R-Sq =92.95%,R-Sq(調(diào)整)=87.08%。表4結(jié)果可知在考察的5個(gè)因素中t1、t2、t3對(duì)色素吸光度的影響顯著(P<0.05)。由T值可看出t1、t2、t3、t5均為正效應(yīng)，即值越高色素的吸光度值越高，t4為負(fù)效應(yīng)，即值越高色素的吸光度值越低。根據(jù)P值和T值最終把響應(yīng)面分析的三個(gè)因素確定為t1、t2、t3，即超聲溫度、料液比、乙醇濃度。

表 4 PB實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Placket-Burman試驗(yàn)選擇超聲溫度、料液比、乙醇濃度3個(gè)因素，根據(jù)2.1結(jié)果分析合理設(shè)計(jì)爬坡方向和步長(zhǎng)，確定超聲時(shí)間5 min，超聲功率100 W。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果見(jiàn)表5，可看出隨著超聲溫度、料液比和乙醇濃度的增大，色素吸光度值呈現(xiàn)逐漸增加又逐漸減少的趨勢(shì)，當(dāng)超聲溫度為40 ℃，料液比為1∶30(g/mL)，乙醇濃度為70%時(shí)的吸光度值為最高，是3因子的最大影響區(qū)域，因此以試驗(yàn)號(hào)4的各因素的水平為中心點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)下一步的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

2.3 BBD試驗(yàn)結(jié)果

黑果枸杞BBD試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6，通過(guò)回歸結(jié)果分析得回歸方程為：

X=0.700 67-0.024 75A+0.003 63B-0.050 12C-0.050 21A×A-0.080 46B×B-0.042 46C×C+0.007A×B+0.02A×C+ 0.017 75B×C

表 5 爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表 6 BBD設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)回歸方程得到超聲溫度、料液比、乙醇濃度的交互作用對(duì)吸光度大小的等高線及3D曲面圖，分別見(jiàn)圖1、2、3。

由圖1所示，曲面陡峭，說(shuō)明超聲溫度、料液比交互作用明顯，色素吸光度值呈現(xiàn)先增大再減小的趨勢(shì)，曲面的頂點(diǎn)即為黑果枸杞色素濃度的最高值，等高線接近橢圓，說(shuō)明兩因素間交互作用明顯。圖2所示，曲面陡峭，說(shuō)明超聲溫度、乙醇濃度交互作用明顯，色素吸光度值呈現(xiàn)先增大再減小的趨勢(shì)，等高線接近橢圓，也說(shuō)明兩因素間交互作用明顯。圖3所示，曲面陡峭，料液比、乙醇濃度交互作用顯著，色素吸光度值呈現(xiàn)先增大再減小的趨勢(shì)，等高線接近橢圓，說(shuō)明兩因素交互作用顯著。

圖 1 超聲溫度、料液比對(duì)吸光度的影響等高線及3D曲面圖

圖 2 超聲溫度、乙醇濃度對(duì)吸光度影響等高線及3D曲線圖

圖 3 料液比、乙醇濃度對(duì)吸光度的影響等高線及3D曲線圖

3 結(jié) 論

通過(guò)Placket-Burman設(shè)計(jì)，從5個(gè)影響黑果枸杞色素提取率的因素中篩選出3個(gè)影響顯著因素，分別是超聲溫度、料液比、乙醇濃度。通過(guò)利用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)逼近最大響應(yīng)值區(qū)域，然后再利用Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化得到了提取效率較好的最佳組合：超聲溫度為39.65 ℃，料液比為1∶28(g/mL)，乙醇濃度為66.51%，超聲時(shí)間為5 min，超聲功率為100 W，吸光度為0.722 8。同時(shí)考慮到了在實(shí)際操作的可行性，現(xiàn)將實(shí)際組合定為超聲溫度為40 ℃，料液比為1∶30(g/mL)，乙醇濃度為65%。此時(shí)吸光度為0.702與理論接近，說(shuō)明運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化提取黑果枸杞色素的工藝是可靠的。