日本無(wú)刺花椒風(fēng)味物質(zhì)的分析研究

何祖新，祝磊，黎江華，彭偉，魏大能，吳純潔*

(1.四川得恩德藥業(yè)有限公司，四川 綿陽(yáng) 621100；2.成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，成都 611137)

花椒系蕓香科花椒屬植物，因其獨(dú)特的“麻辣鮮香”被用來(lái)作為食品調(diào)味料，也被譽(yù)為中國(guó)“八大味”之一，在川渝地區(qū)更是麻辣味川菜、涼菜及火鍋中必不可少的調(diào)味品?；ń分饕t花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)、青花椒(ZanthoxylumschinifoliumSieb. Et Zucc.)和竹葉椒(ZanthoxylumarmatumDC.)[1]，主要的商品有紅花椒、青花椒、藤椒等。花椒既是香料，也是藥用經(jīng)濟(jì)作物。近年來(lái)，各地在農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、新一輪退耕還林及脫貧攻堅(jiān)等實(shí)施過(guò)程中，將花椒作為主要經(jīng)濟(jì)作物之一，其種植面積與產(chǎn)量得以迅速增加，并形成了以陜西(韓城)、甘肅(武都)、山東(泰安)、四川(漢源、金陽(yáng)、茂汶、三臺(tái)、洪雅等)、重慶(江津)、云南(昭通)等省市為核心區(qū)域的全國(guó)聞名花椒基地[2]。四川作為花椒的重要產(chǎn)區(qū)，已出臺(tái)相關(guān)扶持政策，明確到2020年打造成為全國(guó)“花椒產(chǎn)業(yè)第一省”[3]。

目前，四川省栽培的“漢源花椒”、“大紅袍”、“九葉青花椒”、“藤椒”等知名品種均為傳統(tǒng)品種，枝條有較多的刺，采摘用工多，還經(jīng)常刺傷手指，制約了規(guī)?；l(fā)展[4]。日本無(wú)刺花椒的果皮、青果、嫩芽、種子等具有重要的應(yīng)用價(jià)值，并因無(wú)刺或少刺，采摘方便，較國(guó)內(nèi)花椒能節(jié)約大量管理用工，極具生產(chǎn)栽培價(jià)值[5,6]。1994年開(kāi)始，日本金村醫(yī)藥株式會(huì)社有關(guān)專(zhuān)家開(kāi)始在國(guó)內(nèi)深圳、四川、河南、河北分別試栽日本花椒(山椒)，但嫁接成活率不高[7]。其后，河北、四川、貴州等省林科院及甘肅隴南市農(nóng)科所等科研院所對(duì)日本無(wú)刺花椒引進(jìn)和培育做了大量研究工作，也培育出部分自己的無(wú)刺品種[8]。日本無(wú)刺花椒的開(kāi)發(fā)利用已成為目前研究的重點(diǎn)，但主要集中在其品種選擇、苗木快繁培育、栽培、經(jīng)營(yíng)管理、病蟲(chóng)害防治等方面，而對(duì)于其“香”、“麻”的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)(風(fēng)味特征)的研究較少。因此，本文采用HS-SPME-GC-MS和HPLC技術(shù)分別對(duì)日本無(wú)刺花椒的香味物質(zhì)和麻味物質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析，以期為后續(xù)日本無(wú)刺花椒的開(kāi)發(fā)利用、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及品質(zhì)評(píng)價(jià)提供參考，并為四川花椒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成熟期日本無(wú)刺花椒：來(lái)源于四川省引種栽培的日本無(wú)刺花椒(朝倉(cāng)山椒)，由廣元市昭化區(qū)太公鎮(zhèn)日本無(wú)刺花椒種植基地提供。

羥基-α-山椒素對(duì)照品、羥基-β-山椒素對(duì)照品、羥基-γ-山椒素對(duì)照品：自制，純度均大于98%；甲醇(分析純)：成都科龍?jiān)噭S；甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；水為自制去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-MS-TQ8040氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司；固相微萃取儀、HP-1510頂空萃取器、100 μm PDMS萃取頭 美國(guó)Supelco公司；Rxi-624Sil MS毛細(xì)管柱 美國(guó)Restek公司；電子天平 德國(guó)賽多利斯公司；中藥粉碎機(jī) 浙江省永康市溪岸五金藥具廠；超聲波清洗器 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；超純水器 成都超純科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

將日本無(wú)刺花椒置于烘箱中，40 ℃低溫干燥，篩去椒目，將干燥果皮粉碎后過(guò)50目篩，備用。

1.3.2 香味物質(zhì)分析[9,10]

1.3.2.1 樣品萃取與脫附

稱(chēng)取日本無(wú)刺花椒(0.3 g)，置于萃取瓶中；230 ℃下活化萃取頭(3 min)，將萃取頭插入萃取瓶中，50 ℃下萃取30 min；再將萃取頭插入氣相色譜儀的進(jìn)樣口，230 ℃下脫附3 min。

1.3.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜條件

采用HP-5(0.25 mm×30 m，0.25 μm)石英毛細(xì)管柱。升溫程序：起始柱溫50 ℃，保持2 min，以4 ℃/min上升至200 ℃，保持5 min；15 ℃/min上升至240 ℃，保持5 min。載氣為高純度氮(N2)，柱前壓53 kPa，分流比36∶1。進(jìn)樣口和接口溫度均為230 ℃；電子轟擊EI離子源，電子能量70 eV；掃描范圍(m/z)50～550，全掃描模式進(jìn)行采集。

1.3.2.3 定性分析

香味物質(zhì)的定性分析由質(zhì)譜儀所帶數(shù)據(jù)包(Wiley Library ver. 9、NIST Library ver. 14和 NIST Library ver. 14s)進(jìn)行自動(dòng)檢索與匹配。本實(shí)驗(yàn)中，僅統(tǒng)計(jì)匹配度大于90的香味物質(zhì)，確保數(shù)據(jù)的嚴(yán)謹(jǐn)性。香味物質(zhì)的定量分析則采用峰面積歸一化法。

1.3.3 麻味物質(zhì)分析[11-13]

1.3.3.1 樣品制備

取日本無(wú)刺花椒0.5 g，精密加入甲醇50 mL，稱(chēng)定重量，超聲處理(功率240 W，頻率40 kHz)30 min，冷卻至室溫，再次稱(chēng)定重量，以甲醇來(lái)補(bǔ)足超聲過(guò)程中減失的重量，搖勻，分析前采用微孔濾膜(0.45 μm)過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

1.3.3.2 液相色譜條件

PHENOMENEX C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：乙腈-水(40∶60)，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.3.3 定量分析

以自制的羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素和羥基-γ-山椒素作為對(duì)照品，配制成系列不同濃度的混合對(duì)照溶液。經(jīng)麻味物質(zhì)定量測(cè)定方法學(xué)考察后，采用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 香味物質(zhì)的定性分析

按上述實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，日本無(wú)刺花椒香味物質(zhì)總離子圖見(jiàn)圖1，GC-MS分析結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 日本無(wú)刺花椒香味物質(zhì)總離子圖Fig.1 Total ion current chromatogram of aroma components of Japanese pepper

表1 日本無(wú)刺花椒香味物質(zhì)的化學(xué)成分Table 1 The chemical composition of aroma components of Japanese pepper

續(xù) 表

由圖1和表1可知，通過(guò)對(duì)日本無(wú)刺花椒的揮發(fā)性成分進(jìn)行GC-MS分析，共鑒定了21個(gè)化合物，占香味化合物總量的99.55%，可反映日本無(wú)刺花椒香味化合物組分的大致情況。主要含有烯烴類(lèi)化合物13個(gè)、酯類(lèi)化合物6個(gè)、醛類(lèi)化合物1個(gè)和醇類(lèi)化合物1個(gè)，分別占香味化合物含量的89.31%，2.83%，5.46%，1.95%。根據(jù)紅花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)的GC-MS分析結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道[14]，紅花椒中主要含有烯類(lèi)、醇類(lèi)、酮類(lèi)、醛類(lèi)、酯類(lèi)等揮發(fā)性成分，以檸檬烯含量最高，乙酸芳樟酯含量次之；相比于紅花椒，日本無(wú)刺花椒則以檸檬烯含量最高，小茴香烯含量次之，說(shuō)明小茴香烯可以作為日本無(wú)刺花椒區(qū)別于紅花椒的香味化合物。

2.2 麻味物質(zhì)的定量分析

2.2.1 色譜行為

在選定的條件下，3個(gè)麻味物質(zhì)的色譜峰均達(dá)到基線分離，分離度與柱效均良好，混合對(duì)照品和樣品的HPLC圖見(jiàn)圖2。

圖2 混合對(duì)照品(A)、樣品(B)的HPLC圖Fig.2 HPLC chromatograms of mixed standards (A) and sample (B)

2.2.2 線性關(guān)系考察

分別稱(chēng)取羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素和羥基-γ-山椒素對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制成含羥基-α-山椒素0.8 mg/mL、羥基-β-山椒素0.032 mg/mL和羥基-γ-山椒素0.028 mg/mL的對(duì)照品溶液，備用。精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液配制成系列不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別進(jìn)樣分析3次，并以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，得到不同對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，各麻味物質(zhì)在各自范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，見(jiàn)表2。

表2 回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)Table 2 Regression equations, liner ranges, and correlation coefficients

2.2.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液(10 μL)，按“1.3.3.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣分析6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果各成分峰面積的RSD分別是羥基-α-山椒素1.24%，羥基-β-山椒素1.32%，羥基-γ-山椒素1.45%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液，按照“1.3.3.2”項(xiàng)下色譜條件，分別于0，4，8，12，18，24 h進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各成分峰面積RSD分別是羥基-α-山椒素1.01%、羥基-β-山椒素1.35%、羥基-γ-山椒素1.89%，表明提取液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取6份日本無(wú)刺花椒(每份0.5 g)，按“1.3.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“1.3.3.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定分析，結(jié)果各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為羥基-α-山椒素0.97%，羥基-β-山椒素1.31%，羥基-γ-山椒素1.16%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.2.6 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取6份日本無(wú)刺花椒(每份0.25 g)，加入混合對(duì)照品適量，按“1.3.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，計(jì)算各成分的平均回收率。結(jié)果表明，羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、羥基-γ山椒素的平均加樣回收率分別為101.23%，98.52%，97.67%；RSD值分別為1.35%，1.58%，2.05%，表明加樣回收結(jié)果良好。

2.2.7 含有量測(cè)定

精密稱(chēng)取3份日本無(wú)刺花椒(每份0.5 g)，按照上述方法進(jìn)行分析測(cè)定，并計(jì)算各成分含有量。結(jié)果表明，日本無(wú)刺花椒中主要含有羥基-α-山椒素，其含量分別是羥基-γ-山椒素和羥基-β-山椒素含量的21，28倍，見(jiàn)表3。

表3 含有量測(cè)定結(jié)果Table 3 The determination results of content mg/g

3 結(jié)論

本文對(duì)日本無(wú)刺花椒的香味物質(zhì)和麻味物質(zhì)進(jìn)行了定性、定量分析，其中，HS-SPME-GC-MS聯(lián)用技術(shù)可準(zhǔn)確分析日本無(wú)刺花椒的香味物質(zhì)，有效分離鑒定出21種化合物，主要為烯烴類(lèi)、酯類(lèi)、醛類(lèi)及醇類(lèi)化合物，并以檸檬烯含量最高，小茴香烯含量次之，2種成分合計(jì)占日本無(wú)刺花椒香味物質(zhì)的66.9%，且小茴香烯也是區(qū)別于紅花椒的香味化合物。本文成功建立了日本無(wú)刺花椒中麻味物質(zhì)的HPLC分析方法，由混合對(duì)照品與樣品的HPLC圖可知，各成分分離效果較理想，適合于麻味物質(zhì)的定量分析；含量測(cè)定結(jié)果表明，日本無(wú)刺花椒主要含有羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素及羥基-γ-山椒素，又以羥基-α-山椒素的含量最高，其含量分別是羥基-γ-山椒素和羥基-β-山椒素含量的21，28倍。本研究分析了日本無(wú)刺花椒的香味物質(zhì)和麻味物質(zhì)，可為日本無(wú)刺花椒的開(kāi)發(fā)利用、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及品質(zhì)評(píng)價(jià)提供借鑒，并為四川花椒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供理論依據(jù)。