大豆球蛋白堿性肽對黑曲霉的抑制效果和機理的研究

郝曼，李迎秋

(齊魯工業(yè)大學 食品科學與工程學院，濟南 250353)

大豆球蛋白堿性肽是從大豆球蛋白中分離提取的一種堿性多肽，屬于陽離子肽，其分子量將近20 kDa，通過1個二硫鍵與大豆球蛋白酸性肽鏈接[1]。有研究報道GBP對一些革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌具有抑菌性[2]。GBP的抑菌機理可能是由于GBP具有陽離子和疏水性，GBP能夠作用于細菌細胞膜，從而抑制細菌的生長。Li等[3]研究表明GBP破壞了細菌細胞膜磷脂雙層結構，增大了細胞膜的滲透性，使大腸桿菌細胞中蛋白質和離子泄露，導致細胞死亡。GBP可以改善巴氏殺菌奶和冷凍豬肉的感官特性，減少細菌總數(shù)(TPC)，從而延長保質期[4]。目前，關于GBP的抗真菌特性的研究較少，尤其是對黑曲霉的抑菌特性研究更少，黑曲霉是導致食物腐敗變質的主要污染菌之一，本文研究了GBP對黑曲霉的抑菌特性，以期望其能夠作為一種天然的防腐劑應用于食品的保鮮。通過牛津杯實驗、孢子萌發(fā)率的測定和生長曲線的測定研究了GBP對黑曲霉的抑菌效果。通過pH和離子泄露的測定研究了GBP對黑曲霉的抑菌機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瓊脂、過氯酸、氯化鉀、硝酸/葡萄糖：杭州昊天生物技術有限公司；黑曲霉：從變質鮮濕面條中分離提純得到；GBP：由實驗室富集所得。

1.2 主要儀器與設備

壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；移液槍 藍宇科技試劑公司；霉菌培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司；光學顯微鏡、pH酸度計 東莞市創(chuàng)瑞檢測設備有限公司；DHZ-C型大容量恒溫振蕩器 普瑞特機械有限公司；SW-CJ-2F雙面凈化工作臺 蘇凈集團安泰公司；原子吸收光譜儀 美國PerkinElmer公司；AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 抑菌效果測試

參考Wang等[5]的方法，采用牛津杯法測定抑菌圈直徑。吸取100 μL孢子懸浮液(1×105孢子/mL)，將其注入無菌培養(yǎng)皿中凝固的察氏培養(yǎng)基表面，無菌涂布棒涂布均勻。取3個牛津杯放置于培養(yǎng)皿中，牛津杯呈正三角形，分別吸取150 mL同濃度的GBP溶液注入其中2個牛津杯中，再吸取150 mL無菌蒸餾水注入第3個牛津杯中作為對照，不同培養(yǎng)皿牛津杯中注入GBP的濃度分別為0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.4 mg/mL，將所有培養(yǎng)皿放置于霉菌培養(yǎng)箱中，28 ℃培養(yǎng)3天，測量抑菌圈直徑。

1.3.2 霉菌孢子萌發(fā)率的測定

采用Tian等[6]的方法研究不同GBP對黑曲霉孢子萌發(fā)的影響。將GBP加入到含有察氏液體培養(yǎng)基和1 mL 0.1%(V/V)吐溫溶液的玻璃試管中，使GBP最終濃度分別為0，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2 mg/mL。將100 μL孢子懸浮液(1×105孢子/mL)接種到上述試管中，從試管中分別吸取10 μL溶液注入凹玻片，蓋上蓋玻片，放置在恒溫培養(yǎng)箱中于28 ℃條件下培養(yǎng)20 h，每個GBP濃度做3個平行，以孢子長出芽管、菌絲作為孢子萌發(fā)的標志。觀察孢子萌發(fā)的情況，計算孢子萌發(fā)率。

采用Tian的方法研究GBP對黑曲霉孢子生長動力的影響。將GBP加入到含有察氏液體培養(yǎng)基和1 mL 0.1%(V/V)吐溫溶液的玻璃試管中，使GBP最終濃度分別為0.4，0.8，1.6 mg/mL。將孢子懸浮液接種到上述試管中，每個試管中分別加入100 μL黑曲霉孢子懸浮液(1×105孢子/mL)，并置于搖床中于28 ℃，100 r/min條件下震蕩培養(yǎng)10，20，30，40，50，60 h，將其在6000 r/min、常溫條件下離心5 min。去掉上清液，將沉淀物懸浮在0.1%吐溫-80溶液中。吸取10 μL的孢子懸浮液加入凹玻片，蓋上蓋玻片，然后置于光學顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)情況，計算孢子萌發(fā)率。

1.3.3 霉菌生長曲線的測定

參照Wu等[7]的方法通過測定霉菌生長曲線來研究GBP對黑曲霉菌絲生長的影響。取數(shù)支試管加入一定量的察氏液體培養(yǎng)基，向試管中接入100 μL黑曲霉孢子懸浮液(1×105孢子/mL)，然后放置在恒溫震蕩培養(yǎng)箱中于28 ℃，150 r/min條件下震蕩培養(yǎng)48 h。向霉菌培養(yǎng)液試管中添加一定量的察氏液體培養(yǎng)基，然后向其中部分試管中加入GBP，使GBP的最終濃度為1.6 mg/mL作為實驗組，其他霉菌培養(yǎng)液試管不加GBP作為對照組。將試管放置在恒溫震蕩培養(yǎng)箱中于28 ℃，150 r/min條件下震蕩培養(yǎng)。在特定的時間將實驗組和對照組的試管從恒溫震蕩培養(yǎng)箱中移出，在4 ℃冰箱中保存一段時間后，將菌液于8000×g條件下離心25 min，去掉上清液，沉淀物放在循環(huán)烘箱中于105 ℃條件下干燥4 h，然后稱重。

1.3.4 細胞外溶液pH測定

參照Tian等[8]的方法探索細胞外溶液酸化情況，以研究GBP對黑曲霉的抑菌機理，將適量的孢子懸浮液(1×107孢子/mL)注入盛有察氏液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，放置于霉菌培養(yǎng)箱中于28 ℃條件下培養(yǎng)48 h。過濾得到菌絲并使用去離子水洗滌2次。稱取菌絲1.0 g，于40 mL 50 mmol/L KCl溶液中懸浮，然后饑餓處理18 h(4 ℃條件下)。將GBP溶液分別注入菌絲懸浮液中，使其中GBP的最終濃度為0，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2 mg/mL。將經(jīng)GBP處理的菌絲懸浮液于室溫條件下靜置10 min，然后加入20 mL 10%葡萄糖溶液，誘導菌絲細胞外溶液酸化。加入葡萄糖溶液后分別在0，30，60，90，120，150 min時用pH酸度計測定菌絲細胞外溶液的pH值。

1.3.5 鈣、鉀離子泄露的測定

參考Wu等的方法測定黑曲霉菌絲細胞外溶液的離子濃度，以研究GBP對黑曲霉細胞膜通透性的影響。吸取100 μL黑曲菌孢子懸浮液(105孢子/mL)接種于含有察氏液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，放置在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h(28 ℃，150 r/min)，將菌液離心10 min(28 ℃，10000×g)，得到菌絲，然后將菌絲用50 mmol/L的3-(N-嗎啉基)丙磺酸緩沖液洗滌2次后重懸于50 mmol/L的3-(N-嗎啉基)丙磺酸緩沖液(含1%葡萄糖)中，分成等份試樣6份。將6份懸浮液加入2種不同濃度的GBP溶液，使菌絲懸浮液中GBP的最終濃度為0，1.6 mg/mL，于搖床中 28 ℃培養(yǎng)。在30，60，90，120，150 min時分別吸取3 mL樣品于消化瓶中，加入硝酸和過氯酸(比例4∶1)的混合酸5 mL，用電熱爐小火加熱，待消化瓶中剩余液體1 mL左右時，繼續(xù)注入混合酸5 mL并小火加熱，如此反復操作，直至消化瓶中呈現(xiàn)透明狀液體后停止加熱。將消化液中液體稀釋至25 mL，使用原子吸收光譜儀測量稀釋液的鈣、鉀離子濃度。

2 結果與討論

2.1 GBP對黑曲霉的抑制效果

圖1 經(jīng)GBP處理后的黑曲霉抑菌圈圖Fig.1 The photos of inhibition zones of A. niger treated with different GBP concentration

通過測定抑菌圈直徑大小來評價GBP對黑曲霉的抑制效果，抑菌圈越大，其抑制作用越顯著。由圖1可知，對照組中牛津杯周圍無抑菌圈出現(xiàn)，而經(jīng)0.4，0.8，1.6 mg/mL GBP處理的出現(xiàn)抑菌圈，且隨著GBP濃度的增大，抑菌圈越明顯。

表1 黑曲霉抑菌圈直徑大小Table 1 The inhibition zones' diameters with different GBP concentration against A. niger

由表1可知，GBP溶液濃度越大，抑菌圈直徑越大。當GBP溶液濃度從0增大到2.4 mg/mL時，黑曲霉培養(yǎng)基的抑菌圈直徑分別從0增大到20.1 mm。以上結果表明GBP對黑曲霉具有較強的抑制作用，一定的濃度范圍內，抑制作用隨GBP濃度的增大而增強。

2.2 GBP對霉菌孢子萌發(fā)的影響

GBP對黑曲霉孢子萌發(fā)的影響見圖2和圖3。

圖2 不同濃度GBP對黑曲霉孢子萌發(fā)的影響Fig.2 The effects of different concentration of GBP on spore germination of A. niger

由圖2可知，GBP能夠抑制黑曲霉孢子的萌發(fā)。未經(jīng)GBP處理的黑曲霉孢子萌發(fā)率為100%，而經(jīng)不同濃度(0，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2 mg/mL)GBP處理的黑曲霉孢子萌發(fā)率明顯低于100%，且隨著GBP濃度的增大而降低。當GBP濃度為1.6，3.2 mg/mL時，孢子萌發(fā)率分別為41%和26%，抑菌效果較為顯著。以上結果說明，GBP能抑制黑曲霉孢子的萌發(fā)，且濃度越大，抑制效果越顯著。

圖3 經(jīng)GBP處理后的黑曲霉生長動力圖Fig.3 The growth kinetics of the inhibition of A. niger treated with GBP

由圖3可知，在0～60 h內，經(jīng)不同濃度(0.4，0.8，1.6 mg/mL)GBP處理的黑曲霉孢子萌發(fā)受到不同程度的抑制，且隨著GBP處理時間的延長和GBP濃度的增大，黑曲霉孢子萌發(fā)率降低。處理10 h時，1.6 mg/mL的GBP對黑曲霉孢子萌發(fā)的抑制率已經(jīng)達到50%；處理60 h時，抑制率達到100%。以上數(shù)據(jù)說明，GBP能抑制黑曲霉孢子的萌發(fā)，且濃度越大，處理時間越長，抑制效果越顯著。

2.3 GBP對霉菌菌絲生長的影響

GBP對黑曲霉菌絲生長的影響見圖4。

圖4 經(jīng)GBP處理后的黑曲霉生長曲線圖Fig.4 The growth curve of A. niger treated with different concentration of GBP

黑曲霉的生長期分為3個階段：停滯期(0～35 h)，對數(shù)生長期(35～65 h)，穩(wěn)定期(65 h以后)。在50 h之內，經(jīng)0，0.16 mg/mL GBP處理的菌絲體干重變化呈現(xiàn)相同的趨勢。經(jīng)過短暫的對數(shù)生長期后，GBP處理的菌絲體干重急劇下降，而對照組中菌絲體干重則呈現(xiàn)增大的趨勢。65 h以后經(jīng)0，0.16 mg/mL GBP處理的菌絲體干重變化逐漸趨于穩(wěn)定，以上數(shù)據(jù)表明，GBP能夠抑制黑曲霉菌絲的生長。

2.4 GBP對霉菌細胞外pH的影響

圖5 GBP對黑曲霉細胞外pH的影響Fig.5 The effects of GBP on the extracellular pH of A. niger

由圖5可知，對照組隨著時間的延長，黑曲霉細胞外溶液的pH值從5.7降低到4.09，下降趨勢較為明顯；而經(jīng)GBP處理的黑曲霉菌絲細胞外溶液的pH值隨著時間的延長下降趨勢則比較平緩，尤其是經(jīng)濃度為1.6，3.2 mg/mL GBP處理的細胞外溶液的pH值下降趨勢最為平緩。當處理時間相同時，GBP濃度越大，pH值越大。以上結果說明，GBP破壞了菌體通過細胞膜上質子泵將細胞內質子轉移到細胞外的功能，從而阻止了葡萄糖誘導的黑曲霉細胞外溶液的酸化，進而導致了黑曲霉菌絲細胞的死亡。GBP濃度越大，阻止細胞外溶液酸化的能力越強。

2.5 GBP對黑曲霉鈣、鉀離子釋放的影響

GBP對細胞膜功能的影響已通過對黑曲霉細胞外溶液pH的測定來評價。在本實驗中，通過對鈣、鉀離子泄露的測定進一步評價GBP對黑曲霉細胞膜的影響。GBP對黑曲霉鈣、鉀離子泄露的影響結果見圖6。

圖6 GBP對黑曲霉菌絲細胞內Ca2+、K+泄露的影響Fig.6 The effects of GBP on leakage of Ca2+, K+ in mycelial cell of A. niger

對照組中黑曲霉菌懸液中的Ca2+、K+濃度升高比較緩慢，150 min后分別達到2.13,1.19 mg/L。經(jīng)1.6 mg/mL GBP處理的黑曲霉菌懸液中Ca2+、K+離子濃度都顯著高于對照組，且隨著時間增大而增大，在150 min后分別達到8.72，2.66 mg/L。因此，GBP可以破壞黑曲霉細胞膜，使其通透性增大，導致Ca2+、K+離子的泄露。

3 結論

本文研究了GBP對黑曲霉的抑制效果和抑菌機理。實驗結果表明GBP對黑曲霉具有較顯著的抑制效果。經(jīng)GBP處理的牛津杯周圍出現(xiàn)明顯的抑菌圈，且黑曲霉抑菌圈直徑隨著GBP濃度的增大而增大；GBP有效抑制了黑曲霉孢子的萌發(fā)和菌絲的生長。GBP通過阻止由葡萄糖誘導的菌絲細胞外溶液的酸化抑制霉菌的生長；GBP也能夠增大黑曲霉菌絲體細胞膜的通透性，使細胞內Ca2+、K+金屬離子泄露，導致細胞死亡。因此，GBP可以作為一種天然的防腐劑應用于食品保鮮。