生髓健骨膠囊對酒精性骨質(zhì)疏松大鼠股骨生物力學(xué)影響的研究

任樹軍 梁彥林 任明輝 王墉琦 譚福柱 邢國利 姜益常

1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040 2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，黑龍江 哈爾濱 150040 3. 西安市中醫(yī)院，陜西 西安 710001 4. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040

酒精性骨質(zhì)疏松[1-3](alcohol-induced osteoporosis，AOP)屬繼發(fā)性骨質(zhì)疏松范疇，是指長期、大量飲酒導(dǎo)致骨礦含量、骨密度、骨量減少而致骨微觀結(jié)構(gòu)破壞及骨力學(xué)性能下降，引起骨折風(fēng)險性增加的一種全身骨代謝性疾病。酒精濫用和酒精依賴導(dǎo)致骨壞死的發(fā)生率正逐漸增加，且缺乏具體量化標(biāo)準(zhǔn)，已成為眾多國內(nèi)外學(xué)者的研究方向[4]。自Saville在1965年發(fā)現(xiàn)過度飲酒者尸體標(biāo)本的骨量顯著降低后，眾多學(xué)者在研究中證實過度飲酒主要通過改變[5]骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞等的增殖、分化，引起脂肪組織增多，造成骨組織形成減少等一系列病理生理變化。主要通過抑制成骨、促進骨吸收，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松最終形成[6-7]。

骨生物力學(xué)[8](biomechanics)是在生物力學(xué)理念上來分析人體在遭受創(chuàng)傷、各種病變以及手術(shù)后的力學(xué)特性，通過其理論對其生物學(xué)效應(yīng)來指導(dǎo)臨床骨折及軟組織損傷的研究，促進了人體肌肉骨骼系統(tǒng)疾病在臨床和基礎(chǔ)研究上的進展，更加有效地對各種創(chuàng)傷、畸形、退變性疾病進行診斷和治療，從而對骨生物力學(xué)有更深的認(rèn)識，提高了臨床療效[9]。

本研究通過建立酒精性骨質(zhì)疏松癥大鼠模型，觀察不同時期的酒精引起模型鼠股骨作用力的變化特征，探討酒精在骨質(zhì)疏松癥形成過程中的作用機制，以研究生髓健骨膠囊對酒精性骨質(zhì)疏松大鼠股骨生物力學(xué)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供清潔級雄性SD大鼠120只，動物合格證號：SCXK(黑)201701030，平均月齡約6個月，體重(220±20)g。按隨機數(shù)字表法分為正常對照組、模型組、西藥對照組、中藥干預(yù)組4組，每組各30只，分籠喂養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，稱大鼠體重。

1.2 實驗主要儀器及藥物

1.2.1實驗儀器：游標(biāo)片尺(精確度0.02 mm，長150 mm)，北京儀器廠生產(chǎn)。電子萬能試驗機(AGS-10KNG型)，日本島津公司生產(chǎn)。

1.2.2主要藥物：生髓健骨膠囊(規(guī)格：0.35 g/粒)，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，批準(zhǔn)文號：黑衛(wèi)藥制字Z20110036；碳酸鈣片[規(guī)格：500 mg/片(以鈣計)]，吉林萬通藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H10980201；阿法D3(規(guī)格：0.25 μg/粒)，以色列TEVA藥廠生產(chǎn)，昆明貝克諾頓公司分裝，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字J20130162；白酒(規(guī)格：500 mL/瓶)，紅星牌55度二鍋頭白酒，北京紅星股份有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)許可證QS110015010349，批號：GB/T20822；生理鹽水(規(guī)格：500 mL/袋)，四川太平洋藥業(yè)有限公司，出廠批號：B1708018。

1.3 實驗方法

健康清潔級雄性SD大鼠白酒灌胃法造模。按10 mL/(kg·d)[含純酒精約4.4 g/(kg·d)]的劑量，每日灌胃1次，共持續(xù)16周。每周稱體重1次，以調(diào)整白酒的用量。分別在8、12、16周時灌胃后禁食禁水12 h后采集標(biāo)本，進行指標(biāo)檢測。

正常對照組：每日上下午用等量生理鹽水灌胃2次。模型組：每日上午用白酒(按10 mL/kg的體重劑量)灌胃+等量生理鹽水灌胃，每日各1次。西藥對照組：每日上午白酒(按10 mL/kg的體重劑量)灌胃+碳酸鈣片[按85 mg/(10 mL·kg)]和阿法D3[按0.05μg/(10 mL·kg)]以生理鹽水配成混懸液灌胃給藥(相當(dāng)于成人等效劑量的10倍)，每日各1次。中藥干預(yù)組：每日上午白酒(按10 mL/kg的體重劑量)灌胃+生髓健骨膠囊按4.7 g/(10 mL·kg)(相當(dāng)成人等效劑量的10倍)以生理鹽水配成混懸液灌胃給藥，每日各1次。以上各組大鼠灌胃容積為10 mL/kg，灌胃給藥時間共持續(xù)16周。實驗期間各組大鼠自由進食和飲水，并給予全價標(biāo)準(zhǔn)營養(yǎng)顆粒飼料。每周稱1次體重，根據(jù)體重調(diào)整用藥劑量。

1.4 取材及檢測方法

于干預(yù)造模后8、12、16周時，用頸椎脫位斷髓法處死各組實驗大鼠，立即剖出包括股骨頭及股骨內(nèi)外髁在內(nèi)的完整左側(cè)股骨，剔除殘余結(jié)締組織及肌肉，在生理鹽水中沖洗并用生理鹽水濕紗布包敷，用游標(biāo)卡尺分別測出股骨中段外徑，算出截面面積并用電子萬能試驗機進行股骨三點彎曲試驗[10](加載點在股骨中段，支點跨距20 mm，加載速度2 mm/min)。計算骨生物力學(xué)指標(biāo)為最大載荷、極限強度、最大撓度、彈性模量。

將制備好的股骨放置于電子萬能試驗機上，測量兩支座間的距離，即跨距，確定加載點。放置好后調(diào)整試驗機十字頭的位置，使之于股骨完全接觸的壓力值為0，設(shè)定十字頭運動加速度、試驗機量程、原始位移等參數(shù)，進行實驗。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

所得實驗數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件進行t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重變化情況

造模前各組大鼠體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。造模后4周空白組與模型組相比較，空白組體重明顯高于模型組(P<0.01)。用藥8、12、16周后西藥對照組、中藥干預(yù)組與模型組相比，體重均明顯升高(P<0.01)；西藥對照組與中藥干預(yù)組相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明西藥對照組體重明顯低于中藥干預(yù)組。見表1。

表1 各組大鼠體重變化比較

注：與正常對照組相比，★P<0.05，★★P<0.01，☆P>0.05；與模型組相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01，△P>0.05；與西藥對照組相比，●P<0.05，●●P<0.01，△P>0.05。

造模前各組體重相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。造模后4周時正常對照組與模型組對比，正常組體重明顯高于模型組(P<0.01)。與模型組相比，用藥8、12、16周后西藥對照組、中藥干預(yù)組體重均明顯升高(P<0.01)；西藥對照組與中藥干預(yù)組相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明中藥干預(yù)組體重明顯高于西藥對照組。

2.2 各組大鼠股骨結(jié)構(gòu)力學(xué)性能比較(表2～4)

表2 用藥8周時各組大鼠股骨結(jié)構(gòu)力學(xué)性能比較

注：與正常對照組相比，★P<0.05，★★P<0.01，☆P>0.05；與模型組相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01，△P>0.05；與西藥對照組相比，●P<0.05，●●P<0.01，△P>0.05。

各組大鼠左側(cè)股骨生物力學(xué)指標(biāo)測定結(jié)果顯示，模型組與空白組比較，大鼠股骨的最大載荷、極限強度、最大撓度、彈性模量均顯著降低(P<0.01)。中藥干預(yù)組和西藥對照組均有不同程度的改善(P<0.05)。中藥干預(yù)組最大載荷、極限強度、最大撓度均優(yōu)于西藥對照組，而彈性模量經(jīng)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 用藥12周時各組大鼠股骨結(jié)構(gòu)力學(xué)性能比較

注：與正常對照組相比，★P<0.05，★★P<0.01，☆P>0.05；與模型組相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01，△P>0.05；與西藥對照組相比，●P<0.05，●●P<0.01，△P>0.05。

表4 用藥16周時各組大鼠股骨結(jié)構(gòu)力學(xué)性能比較

注：與正常對照組相比，★P<0.05，★★P<0.01，☆P>0.05；與模型組相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01，△P>0.05；與西藥對照組相比，●P<0.05，●●P<0.01，△P>0.05。

3 討論

隨著經(jīng)濟的發(fā)展，酒的消耗量也在增加。在各種社交中，飲酒往往是最常見的一種方式，而飲酒發(fā)生的悲痛教訓(xùn)值得我們重視[11]。酗酒主要抑制成骨細(xì)胞和BMSCs的增殖而促進其向成脂細(xì)胞的分化[5，12]。骨細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，打破了骨吸收和形成的動態(tài)平衡，從而使骨皮質(zhì)變薄、骨小梁數(shù)量減少、骨髓腔增大、骨礦化障礙等一系列病理改變，導(dǎo)致骨生物力學(xué)的改變[13-16]。《素問·本神篇》云：“脾藏營，營舍意，脾氣虛則四肢不用，五臟不安”，《素問·痿論》曰：“脾主身之肌肉”，肌肉豐滿壯實乃骨骼強壯的力學(xué)保證[17-18]。骨生物力學(xué)常通過骨結(jié)構(gòu)力學(xué)特征變化和內(nèi)在質(zhì)量來反映其抵抗破壞和變形能力的大小?，F(xiàn)常用的骨生物力學(xué)試驗是三點彎曲試驗，主要測定骨組織對抗外力后的力學(xué)特征和生物學(xué)效應(yīng)[19-20]。實驗測定的指標(biāo)包括最大載荷、最大撓度、彈性模量和極限強度，其中最大載荷直接反映骨小梁的骨質(zhì)、結(jié)構(gòu)的連續(xù)性、骨皮質(zhì)的強度等，是對骨質(zhì)量的綜合反應(yīng)；最大撓度可反映出骨小梁在垂直于軸線方向上的線位移，即最大變形長度；彈性模量為衡量股骨產(chǎn)生彈性變形難易程度的指標(biāo)，其指越大，發(fā)生一定彈性變形的應(yīng)力也越大，即剛度越大，亦即在一定應(yīng)力作用下發(fā)生彈性變形越?。粯O限強度即導(dǎo)致骨折所需的應(yīng)力[21-22]。上述指標(biāo)主要反映出骨的結(jié)構(gòu)力學(xué)特征的變化，它主要受到骨重建過程中幾何形狀變化的影響。

中醫(yī)將骨質(zhì)疏松癥歸于“骨痿”或“骨痹”的范疇[23]。中醫(yī)理論方面認(rèn)為，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生與脾腎密切相關(guān)，腎虛是其根本原因，脾虛是主要因素之一，兩臟俱虛，可共同導(dǎo)致該病的發(fā)生[24]?！鹅`樞·經(jīng)絡(luò)》篇曰：“足少陰氣絕，則骨枯……骨不濡則肉不能著也；骨肉不相親則肉軟卻……發(fā)無澤者骨先死”。骨的生長、發(fā)育、強勁、衰弱與腎精盛衰關(guān)系密切，腎精為骨髓生化之源，骨骼得以滋養(yǎng)；腎精虧虛則骨骼失養(yǎng)而痿弱無力[25]?！端貑枴ぬ庩柮髡摗吩唬骸八闹韵須庥谖?，而不得至經(jīng)，必因于脾乃當(dāng)?shù)孟硪病?。脾為后天之本，主運化，運化不力則脾精不足，腎精乏源，而致骨痿；脾氣虛，津液不布，倦怠乏力，肌肉消瘦而致骨痿[26]。補腎健脾益氣法是骨質(zhì)疏松癥治療的重要法則[27]。前期研究表明，補腎健脾益氣法能夠提高酒精性骨質(zhì)疏松大鼠骨密度和骨礦含量，抑制骨礦丟失[28]，同時又能夠上調(diào)小腸組織內(nèi)VDR mRNA的表達，提高對1,25-(OH)2D3的反應(yīng)活性，促進腸鈣、磷的吸收，促進骨形成，抑制骨丟失，有效改善骨代謝，提高骨質(zhì)量，改善骨強度和硬度，提高骨生物力學(xué)指標(biāo)[10]。生髓健骨膠囊針對“脾腎相關(guān)論”及對酒精性骨質(zhì)疏松的病機特點，由《醫(yī)學(xué)正傳》里的鹿角丸化裁而來，方中龜板、鹿角膠補先天為君，補腎壯骨、填精生髓。鹿角膠益精血，偏補腎陽；龜板性補腎養(yǎng)陰，偏補腎陰，一陰一陽，二藥合用，以達陰陽并補之功?！夺t(yī)經(jīng)精義》曰：“精足則髓足，髓在骨內(nèi)，髓足則骨強”。生黃芪、熟地、當(dāng)歸、白術(shù)培補后天為臣。生黃芪、熟地黃二藥相伍，滋陰健脾，益氣養(yǎng)血。黃芪、當(dāng)歸兩藥相合配伍，則氣旺血生，陽生陰長。生黃芪、熟地、當(dāng)歸合用可助君藥生補精血之功。白術(shù)健脾燥濕利水，可針對酒毒痰濕之疾。葛根、郁金、地龍、牛膝、丹參為佐藥，牡蠣、龍骨合為使藥，全方標(biāo)本兼顧，配伍緊密，具有補腎生髓、健脾益氣、健骨養(yǎng)陰、活血止痛之功效[29]。

本研究各組大鼠左側(cè)股骨生物力學(xué)指標(biāo)測定結(jié)果顯示，模型組與空白組比較，大鼠股骨的最大載荷、極限強度、最大撓度、彈性模量均顯著降低(P<0.01)，這說明大鼠在白酒灌胃后生物力學(xué)性能均下降。中藥干預(yù)組和西藥對照組均有不同程度改善(P<0.05)。中藥干預(yù)組最大載荷、極限強度、最大撓度均優(yōu)于西藥對照組，而彈性模量經(jīng)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，這可能在制備游離樣本時破壞了骨小梁的邊界結(jié)構(gòu)連接。另外，如施加的壓力與骨正常受力方向不一致，也會導(dǎo)致較小的彈性模量。這說明大鼠在白酒灌胃后隨著骨質(zhì)含量的逐漸下降，骨生物力學(xué)性能也不斷下降。應(yīng)用生髓健骨膠囊會使骨生物力學(xué)性能的各項指標(biāo)，如最大載荷、極限強度、最大撓度、彈性模量明顯改善，提高骨硬度和骨彈性，通過中西藥對AOP大鼠的治療作用進行對比分析，以期為骨質(zhì)疏松發(fā)生過程中脾腎相關(guān)性研究提供實驗依據(jù)，值得進一步運用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)深入研究其作用機制及藥理作用。