養(yǎng)殖鰣魚細(xì)菌病病原菌分離、鑒定及藥敏試驗(yàn)

宮子慧 孫修云 王守軍 王 燕 李忠偉

美洲鰣魚肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美，營養(yǎng)價(jià)值極高，是深受廣大消費(fèi)者喜愛的名貴水產(chǎn)品，市場需求量較大，近年來逐漸形成了養(yǎng)殖熱潮。隨著近年養(yǎng)殖效益的提高，在高密度的養(yǎng)殖條件下，鰣魚病害的發(fā)生也逐漸增多。2018年1月，江蘇泗洪縣鰣魚養(yǎng)殖場的鰣魚出現(xiàn)死亡，該養(yǎng)殖場為溫室大棚養(yǎng)殖，養(yǎng)殖面積2500m2，瀕臨死亡的鰣魚350g左右，患病個(gè)體體表受傷，肌肉出現(xiàn)不同程度的糜爛，解剖病魚內(nèi)臟器官并未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重病變。筆者對(duì)發(fā)病個(gè)體進(jìn)行了病原菌分離及藥敏試驗(yàn)。

1 方法

病原菌的分離：用滅菌棉簽蘸取鰣魚內(nèi)臟，均勻涂于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)18～24h后，觀察菌落形態(tài)，并挑取可疑單個(gè)菌落劃線接種在營養(yǎng)瓊脂平板，28℃恒溫培養(yǎng)18～24h。從營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上挑取單菌落劃線接種于脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂平板上，28℃培養(yǎng)18～24h，觀察是否有透明圈。

生理生化特征：采用腸桿菌和其他非苛養(yǎng)革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒（比色法）系統(tǒng)測定各分離菌株生理生化特性，同時(shí)做氧化酶反應(yīng)構(gòu)成第21個(gè)試驗(yàn)。根據(jù)判讀表判讀各反應(yīng)結(jié)果，參照生化譜檢索手冊，得到鑒定結(jié)果。

藥敏試驗(yàn)：挑取單菌落于5mL生理鹽水中制成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙海ˋ管），從中吸取0.1mL，加入到10mL無菌生理鹽水中混勻（B管）。利用微量移液器吸取B液，加入藥敏板所有的微孔中，每孔0.1mL，分別測定細(xì)菌分離株對(duì)恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、紅霉素、乳酸環(huán)丙沙星、鹽酸土霉素、強(qiáng)力霉素共8種常見藥物的敏感程度。蓋好試劑板，置于35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24h，經(jīng)肉眼觀察證實(shí)無細(xì)菌生長試管中的最低藥物濃度，即為藥物的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

2 結(jié)果

從鰣魚內(nèi)臟分離到的細(xì)菌在營養(yǎng)瓊脂平板上為光滑、濕潤、微凸、無色或淡黃色菌落，在脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂平板上，菌落周圍出現(xiàn)清晰、透明的溶蛋白圈。

對(duì)分離得到的2株細(xì)菌進(jìn)行生理生化檢測，結(jié)果判定：分別為致病性嗜水氣單胞菌1型和致病性嗜水氣單胞菌2型，編碼分別為7046126、7247164。具體生理生化特性見表 1。

2株致病性嗜水氣單胞菌對(duì)8種抗菌藥物的最小抑菌濃度如表2所示。

不同抗生素藥敏試驗(yàn)的敏感性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)有所不同，參照2013年抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，將所有抗菌藥物對(duì)各表中菌株的MIC值測定結(jié)果進(jìn)行判定，得出了所有菌株對(duì)各抗生素的感受性結(jié)果，如表3所示。

3 討論與分析

試驗(yàn)分離到的2個(gè)細(xì)菌分離株，根據(jù)其培養(yǎng)后的菌體形態(tài)特征、生化特性分析結(jié)果，分別確定為致病性嗜水氣單胞菌1型和2型。致病性嗜水氣單胞菌在自然界尤其是水中廣泛分布，是引起魚類疾病的主要病原。鰣魚對(duì)低溫敏感，因此，在養(yǎng)殖中應(yīng)該重視早期預(yù)防養(yǎng)殖鰣魚的感染或繼發(fā)感染引起的細(xì)菌性疾病，并通過合理使用抗菌藥及時(shí)治療。

表1 鑒定試劑條檢測結(jié)果

表2 2株致病性嗜水氣單胞對(duì)8種抗菌藥物的最小抑菌濃度（MIC）對(duì)照表（單位：mg/L）

表3 2株致病性嗜水氣單胞菌對(duì)8種抗生素感受性測定結(jié)果（單位：株）

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，2株致病性嗜水氣單胞菌細(xì)菌對(duì)恩諾沙星、硫酸新霉素的敏感率均較高，為100%，對(duì)甲砜霉素耐藥率較高，為100%，對(duì)其他5種抗菌藥的敏感率、中敏率和耐藥率都有一定的比例，致病性嗜水氣單胞菌1型明顯比2型對(duì)藥物更加敏感。