六味地黃丸在胰島素抵抗的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的作用

于 洋 李 垚 林宇涵

(錦州醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001)

胰島素抵抗(IR)是2型糖尿病(T2DM)及其血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的最重要和最根本原因〔1〕。糖尿病(DM)代謝紊亂時造成的氧化應(yīng)激(OS)不但是T2DM及血管并發(fā)癥的重要機(jī)制，也是導(dǎo)致IR狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞功能不全(ECD)發(fā)病機(jī)制中重要的作用環(huán)節(jié)〔2〕。 “補(bǔ)陰方藥之祖”六味地黃丸(LWDHP)具有抗OS、降糖降脂之功效，臨床應(yīng)用其治療因OS引起的DM取得非凡的效果〔3〕。本實(shí)驗(yàn)通過研究LWDHP對IR狀態(tài)內(nèi)皮細(xì)胞的活性氧(ROS)含量、非(不)對稱二甲基精氨酸(ADMA)濃度及相關(guān)基因二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)2表達(dá)的影響，以期揭示LWDHP對IR的作用及改善機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株 EA.hy926人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2主要試劑 LWDHP(濃縮丸)，北京同仁堂(國藥準(zhǔn)字Z19993068)；DDAH2一抗，鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)一抗，美國Proteintech Group公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠IgG二抗，Cell Signaling Technology公司；RT-PCR試劑盒，TaKaRa公司；軟脂酸(PA)，Sigma公司；二甲雙胍(MET)，上海生工生物工程有限公司；ADMA的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；ROS檢測試劑盒、DCFH-DA熒光探針，碧云天生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3LWDHP中藥組含藥血清的制備 SPF級SD大鼠〔遼寧長生生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(遼)2010-0001〕，體質(zhì)量300～350 g，雌雄各半。標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，按隨機(jī)數(shù)字法分為兩組，34只為正常對照組，18只為LWDHP中藥組。中藥組給予LWDHP粉末水溶液(生藥質(zhì)量濃度為15 g·kg-1·d-1)灌胃，3 ml/次/只，2次/d；正常對照組給予等體積的生理鹽水，連續(xù)灌胃5 d。第6天于末次給藥1～2 h后10%水合氯醛腹腔麻醉，1.5 ml/只，打開腹腔，腹主動脈采血，血液自然凝固分離血清，56℃水浴滅活30 min，過濾除菌，分裝，封口，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)基中ADMA濃度 調(diào)整細(xì)胞密度為0.5×105個/ml接種到96孔培養(yǎng)板中，分為正常對照組、模型組(PA組)、LWDHP中藥組(2.5%、5.0%、10.0%含藥血清)、MET組，于37℃、5% CO2的孵育箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞90%生長融合后，正常對照組、PA組和MET組加入無血清的DMEM培養(yǎng)基及空白血清(終濃度為20%)；LWDHP中藥組加入LWDHP含藥血清，終濃度分別為2.5%、5.0%、10.0%，另以空白血清將血清終濃度補(bǔ)充為20%；MET組加入MET使其終濃度為2 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)干預(yù)保護(hù)24 h。加入PA使其終濃度為400 μmol/L，孵育1 h后，再加入胰島素使其終濃度為50 nmol/L，PA作用細(xì)胞24 h后，收集各組培養(yǎng)基。按照ADMA濃度檢測試劑盒的步驟進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定OD值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中ADMA濃度。

1.5細(xì)胞內(nèi)ROS檢測 6孔培養(yǎng)板接種HUVEC，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長至70%～80%融合度，藥物處理同1.4，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞3次，然后加入10 μmol/L DCFH-DA,培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，每隔3～5 min顛倒混勻一次，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無血清DMEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。使用多功能酶標(biāo)儀在488 nm激發(fā)波長、525 nm發(fā)射波長下檢測熒光強(qiáng)度。

1.6RT-PCR測定細(xì)胞DDAH2 mRNA的表達(dá) 將細(xì)胞按5×105個/ml 密度接種到25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，分成正常對照組、PA組、5% LWDHP含藥血清治療組、MET組。各組細(xì)胞藥物處理同1.4，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA。隨后用RT-PCR 試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及聚合酶鏈反應(yīng)。β-actin上游引物序列：5′-ACACGAAAGCAATGCTATCACCTC-3′，下游引物序列：5′-TGACAGCAGTCGGTTGGAGCGA-3′，擴(kuò)增片段長度153 bp。反應(yīng)條件為94℃ 2 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，72℃ 5 min，40個循環(huán)。DDAH2上游引物序列：5′-TTCTCCACCAACTCTGTCCTC-3′，下游引物序列：5′-CAACCGCTCGGATTTCTTA-3′，擴(kuò)增片段長度124 bp。反應(yīng)條件：退火56℃，32個循環(huán)。通過凝膠成像系統(tǒng)以DDAH2條帶光密度值和對應(yīng)的β-actin條帶光密度值的比值表示DDAH2 mRNA的表達(dá)量。

1.7Western印跡測定細(xì)胞DDAH2蛋白表達(dá) 細(xì)胞分組同1.6，加藥處理同1.4，收集細(xì)胞提總蛋白。調(diào)整各組的蛋白質(zhì)上樣量(40 μg)，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉37℃水浴震蕩封閉1 h，加入DDAH2一抗(1∶500稀釋)，4℃過夜。含吐溫-20的Tris緩沖液(TBST)清洗3次，5 min/次，HRP標(biāo)記IgG二抗(1∶2 000稀釋)，TBST清洗4次，5 min/次，37℃水浴震蕩2 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，掃描條帶，以GAPDH作為內(nèi)參，DDAH2和GAPDH蛋白表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行灰度比值顯示DDAH2相對表達(dá)量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析后進(jìn)行組間LSD分析。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞培養(yǎng)基中ADMA濃度測定 模型組ADMA濃度〔(7.61±0.55)μmol/L〕明顯增高，與正常對照組〔(3.57±0.32)μmol/L〕比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。2.5% LWDHP含藥血清組的ADMA濃度〔(7.18±0.44)μmol/L〕降低不明顯，與模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，5.0%和10.0% LWDHP含藥血清和MET能顯著降低ADMA濃度，分別為(5.96±0.27)，(5.73±0.35)，(5.96±0.47)μmol/L，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2各組細(xì)胞內(nèi)ROS含量的檢測 模型組細(xì)胞內(nèi)ROS含量(70.26±1.61)明顯增高，與正常對照組(20.69±1.34)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。2.5% LWDHP含藥血清組的ROS含量(68.25±0.55)降低不明顯，與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，5.0%和10.0% LWDHP含藥血清和MET能顯著降低ROS含量(分別為52.58±0.66，54.47±0.97，56.50±1.10)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3LWDHP對細(xì)胞DDAH2 mRNA表達(dá)的影響 與正常對照組(0.476 2±0.000 1)比，PA組(0.335 6±0.001 1)細(xì)胞內(nèi)DDAH2 mRNA的表達(dá)量顯著降低(P<0.01)。與PA組比，5% LWDHP含藥血清組(0.458 8±0.000 7)和MET組(0.577 2±0.000 6)細(xì)胞內(nèi)DDAH2 mRNA表達(dá)量明顯升高(P<0.01)，說明 LWDHP預(yù)處理可以促進(jìn)PA誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞內(nèi)DDAH2 mRNA的表達(dá)量。見圖1。

圖1 各組細(xì)胞DDAH2 mRNA表達(dá)的比較

2.4LWDHP對細(xì)胞DDAH2 蛋白表達(dá)的影響 與正常對照組(0.286 6±0.000 4)比較，PA組(0.110 9±0.000 3)細(xì)胞內(nèi)DDAH2蛋白的表達(dá)量顯著下降(P<0.01)。5% LWDHP含藥血清組(0.350 4±0.000 7)和MET組(0.271 9±0.000 3)與PA組比較，細(xì)胞內(nèi)DDAH2蛋白表達(dá)量均升高(P<0.01)，意味著 LWDHP同樣也可以促進(jìn)PA誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞內(nèi)DDAH2蛋白的表達(dá)。見圖2。

圖2 各組細(xì)胞DDAH2 蛋白表達(dá)的比較

3 討 論

IR是指各種原因使胰島素作用的靶器官或靶組織對內(nèi)源性或外源性胰島素的敏感性及反應(yīng)性下降，葡萄糖攝取和利用的效率下降，機(jī)體代償性分泌過多胰島素產(chǎn)生高胰島素血癥。目前認(rèn)為DM的病理發(fā)病基礎(chǔ)之一是IR〔4〕。有學(xué)者提出“共同土壤學(xué)說”，即OS是IR、DM和心血管疾病的共同發(fā)病基礎(chǔ)，目前已經(jīng)成了不爭的事實(shí)。而且在OS導(dǎo)致的疾病中，與IR及DM的關(guān)系一直是國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)〔5〕。

有學(xué)者認(rèn)為IR引起的ECD會導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞(EC)產(chǎn)生更多的ROS〔6〕。有實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明PA損傷HUVEC后,細(xì)胞裂解液中的抗氧化酶總超氧化物歧化酶(SOD)活性下降，氧自由基最重要的終產(chǎn)物之一丙二醛(MDA)含量增高，ROS產(chǎn)生的關(guān)鍵酶NADPH 氧化酶(NOX)4 mRNA和蛋白的表達(dá)量明顯升高〔7〕。本實(shí)驗(yàn)研究也證明了PA損傷HUVEC造成IR狀態(tài)后，細(xì)胞內(nèi)ROS含量明顯增高，就說明IR會使EC嚴(yán)重受損,膜的完整性被破壞,更加證明了PA可通過NOX4誘導(dǎo)EC產(chǎn)生ROS，從而對細(xì)胞造成氧化損傷。

ADMA是一種廣泛存在于組織和細(xì)胞中的天然氨基酸，近幾年已經(jīng)成為一種新的心血管疾病的危險(xiǎn)因子。臨床實(shí)驗(yàn)研究表明，T2DM患者在內(nèi)皮依賴性血管舒張功能減弱的同時會有ADMA水平升高，而且ECD的嚴(yán)重程度與血漿中ADMA水平呈正相關(guān)，就能夠推測ADMA可能是IR與DM及其血管并發(fā)癥發(fā)生的一種強(qiáng)大的而且獨(dú)立的評價(jià)血管ECD一種新的危險(xiǎn)預(yù)測因子〔8〕。90%以上的ADMA是在DDAH2的作用下降解失活的，生成胍氨酸、二甲基或單甲基，經(jīng)腎臟排出體外。因此，DDAH2活性大小對調(diào)節(jié)ADMA的水平起著關(guān)鍵性作用，那么導(dǎo)致DDAH2活性降低的因素均可引起ADMA濃度增加〔9〕。本實(shí)驗(yàn)中在PA損傷HUVEC后，檢測到細(xì)胞培養(yǎng)基中ADMA濃度明顯增高，細(xì)胞內(nèi)DDAH2 mRNA和蛋白的表達(dá)量顯著降低，推測損傷的EC中ADMA-DDAH2代謝軸存在異常，說明ECD時造成的OS反應(yīng)導(dǎo)致了DDAH2下降，從而增加了ADMA濃度，進(jìn)一步加重OS反應(yīng)。

氣虛陰虧是DM 發(fā)生的基本病因病機(jī)，LWDHP是滋補(bǔ)氣陰兩虛的傳統(tǒng)名方，臨床上用以治療DM顯現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢〔10〕。有學(xué)者對LWDHP清除自由基、抗氧化的作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)LWDHP能提高睡眠剝奪大鼠血清SOD活性，加速自由基清除〔11〕。本實(shí)驗(yàn)研究表明LWDHP含藥血清能顯著降低ROS含量，同時促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)DDAH2 mRNA和蛋白的表達(dá)，從而降低ADMA的含量，證明LWDHP含藥血清能降低PA對HUVEC的氧化損傷程度，抑制OS反應(yīng)，增強(qiáng)抗氧化作用，有助于改善受損血管EC功能。