PKM2、ENO1和VEGF在河湟谷地胃腺癌患者中的表達(dá)及意義

于鵬杰 張成武 燕 速 馬新福 王煥麗

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤外科一(胃腸)，青海 西寧 810001)

胃癌是全球第四位最常見惡性腫瘤，其死亡率居全球癌癥死亡譜的第2位〔1〕。胃腺癌是發(fā)生于中老年人的常見腫瘤，起源于胃黏膜表面的上皮，其形成與飲食、環(huán)境、幽門螺旋桿菌(Hp)感染及機(jī)體的免疫力等有關(guān)。胃腺癌形成前黏膜上皮的異型增生是其前期病變。胃癌的發(fā)病率及死亡率在歐美等國呈現(xiàn)下降趨勢〔2〕，但是在亞洲尤其是中國的西北地區(qū)胃癌的發(fā)病率及死亡率仍然呈現(xiàn)較高水平。河湟谷地是指我國青藏高原達(dá)坂山與積石山之間，黃河上游與湟水河流域在青海省境內(nèi)東部地區(qū)形成的肥沃三角地帶，是青海省主要的農(nóng)業(yè)區(qū)，前期研究顯示〔1,2〕，該地區(qū)是我國胃癌高發(fā)區(qū)及高死亡率地區(qū)之一，而且胃癌的發(fā)生及發(fā)展呈現(xiàn)不同的生物學(xué)行為，如該地區(qū)胃癌的發(fā)生與慢性胃病背景，Hp感染率高及遺傳等因素有關(guān)，具有高侵襲性；進(jìn)展期胃癌以低中分化腺癌為主，易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及神經(jīng)脈管侵犯等。腫瘤形成時涉及多種基因和蛋白的異常表達(dá)，并促進(jìn)病變進(jìn)展〔2〕。丙酮酸激酶是糖酵解過程中的限速酶，能對磷酸烯醇式丙酮酸進(jìn)行催化，轉(zhuǎn)變成丙酮酸，繼而產(chǎn)生能量。丙酮酸激酶共有4種同工酶，其中丙酮酸激酶同工酶(PK)M2是重要的酶，其不僅催化作用明顯，在腫瘤的進(jìn)展中還具有重要的調(diào)節(jié)作用〔3〕。烯醇酶(ENO)1作為糖酵解途徑的關(guān)鍵酶和多功能蛋白，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。研究顯示ENO1可能對血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)有一定的調(diào)節(jié)作用〔4〕。本實驗對胃腺癌中PKM2、ENO1和VEGF的表達(dá)特征進(jìn)行觀察，分析其意義。

1 材料和方法

1.1臨床資料 2015年2月至2016年2月在青海大學(xué)附屬醫(yī)院確診為胃腺癌并行根治術(shù)的患者102例為觀察組，年齡35～86歲，平均(59.9±13.4)歲，其中男53例，女49例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合WHO中胃腺癌的標(biāo)準(zhǔn)及分型；②首次確診；③患者或家屬均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前放、化療；②有消化系統(tǒng)手術(shù)史；③伴有其他器官惡性腫瘤。經(jīng)病理學(xué)確診為胃黏膜高級別上皮內(nèi)瘤變的術(shù)后組織24例為對照組1，男13例，女11例，年齡37～84歲，平均(57.3±12.1)歲；病理學(xué)確診為胃黏膜低級別上皮內(nèi)瘤變的內(nèi)鏡咬檢組織24例為對照組2，男女各12例，年齡39～79歲，平均(58.3±11.5)歲；距腫瘤邊緣>5 cm的非腫瘤性胃黏膜組織24例為對照組3，男女各12例，年齡38～81歲，平均(57.5±11.5)歲。各組一般臨床特征比較無明顯差別(P>0.05)。

1.2PKM2、ENO1和VEGF檢測方法 4組樣本均常規(guī)取材、固定、脫水、包埋并切取4 μm切片。PKM2、ENO1和VEGF的試劑(濃縮液)均購自武漢博士德生物公司。三者的檢測均應(yīng)用免疫組化SP法，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。先進(jìn)行預(yù)實驗，并選擇染色最理想的濃度用于正式實驗。正式實驗均由同一技師操作，嚴(yán)格按實驗步驟，做好質(zhì)控工作。

1.3PKM2、ENO1和VEGF結(jié)果的判定 以上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)淡黃、棕黃、黃褐色為陽性。著色強度評分：無著色為0分，弱著色為1分，中等程度著色為2分，強著色為3分。選擇上皮細(xì)胞分布區(qū)且染色較為明顯的區(qū)域進(jìn)行計數(shù)，共選擇5個高倍(400倍)顯微鏡下的視野，取平均值，以<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。以二者相乘的得分進(jìn)行評價，分值范圍是0～9分，以≤4分為陰性，>4分為陽性。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SAS6.12統(tǒng)計學(xué)軟件行χ2檢驗、t檢驗、線性相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1PKM2、ENO1和VEGF比較 4組PKM2、ENO1和VEGF陽性表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 PKM2、ENO1和VEGF陽性表達(dá)〔n(%)〕

2.2觀察組中PKM2、ENO1和VEGF在不同臨床病理特征中的表達(dá) PKM2、ENO1和VEGF的表達(dá)在不同腫瘤最大徑、增殖指數(shù)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期患者中有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，PKM2、ENO1的表達(dá)在不同分化程度患者中有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。見表2。

表2 觀察組中PKM2、ENO1和VEGF在不同臨床病理特征中的表達(dá)〔n(%)〕

2.3觀察組中PKM2、ENO1和VEGF的相關(guān)性 PKM2和VEGF(r=0.40，P=0.040)、ENO1和VEGF(r=0.38，P=0.049)呈正相關(guān)。其余指標(biāo)間未見明顯相關(guān)(P>0.05)。

3 討 論

胃腺癌臨床表現(xiàn)為侵襲性的生物學(xué)行為，轉(zhuǎn)移率高，浸潤性強，生物學(xué)行為不良，預(yù)后較差。胃腺癌間質(zhì)富于血管，可以觀察到腫瘤進(jìn)展時血管新生。VEGF是重要血管生成促進(jìn)因子，可以引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂和繁殖，可以使高增殖性腫瘤緩解缺氧的狀態(tài)，并提供必要的營養(yǎng)〔5,6〕。PKM2是新發(fā)現(xiàn)的腫瘤乏氧代謝標(biāo)志分子，表達(dá)升高預(yù)示著細(xì)胞缺氧的狀態(tài)，并為腫瘤乏氧狀態(tài)下血管新生提供支持〔7〕。ENO1是F框/WD-40域蛋白(FBXW)7的靶蛋白，可以被FBXW7泛素連接酶在翻譯后進(jìn)行調(diào)控，而FBXW7缺失可以誘導(dǎo)ENO1 蛋白水平明顯增加〔8〕。ENO1可以作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激蛋白，在細(xì)胞質(zhì)中起催化作用〔9〕。ENO1在生理過程中發(fā)揮作用主要是由細(xì)胞內(nèi)定位和內(nèi)在編碼結(jié)構(gòu)決定的，細(xì)胞膜中ENO1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，胞質(zhì)中ENO1可促進(jìn)腫瘤生長和運動。胞質(zhì)中ENO1是糖酵解的關(guān)鍵酶〔10〕。ENO1在上皮性惡性腫瘤中表達(dá)的是癌基因樣作用，即在氧充分的情況下，惡性腫瘤細(xì)胞仍有較強的糖酵解過程。而事實上在惡性腫瘤進(jìn)展中糖酵解作用明顯增強，作為這個途徑的關(guān)鍵酶，ENO1存在一個跨胞質(zhì)的COOH端，通過這個區(qū)域活化及穩(wěn)定纖溶酶原，腫瘤細(xì)胞進(jìn)行入侵和轉(zhuǎn)移〔11〕。本研究提示PKM2、ENO1和VEGF是促進(jìn)胃腺癌病變形成的重要因素，PKM2、ENO1誘導(dǎo)腫瘤形成與其對增殖的調(diào)控有關(guān)，主要與伴侶蛋白結(jié)合到PKM2結(jié)構(gòu)域上并進(jìn)行折疊有關(guān)。VEGF的作用可能途徑更多，包括對血管生成，對增殖的調(diào)控等。本研究提示PKM2、ENO1和VEGF是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、生長和轉(zhuǎn)移的重要蛋白質(zhì)因素。PKM2、ENO1參與腫瘤細(xì)胞的生長過程，尤其是PKM2、ENO1高表達(dá)后，使腫瘤細(xì)胞停滯于幼稚階段，引起腫瘤細(xì)胞的失控性增生，細(xì)胞相對原始，細(xì)胞的形態(tài)異型明顯，增殖程度高并具有多向分化的潛能〔12,13〕。本研究提示PKM2、ENO1均可以通過促進(jìn)VEGF表達(dá)起到明顯的促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用，即PKM2、ENO1通過介導(dǎo)VEGF表達(dá)發(fā)揮促進(jìn)血管生成的作用。PKM2對腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白調(diào)節(jié)作用明顯，通過誘發(fā)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)腫瘤遷移〔14〕。ENO1還可以作用于磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)途徑，也能被弗林蛋白酶激活，參與組織的生理、病理改造過程。PKM2、ENO1和VEGF是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的促進(jìn)蛋白，這與腫瘤的高遷移性有關(guān)。由于TNM分期是與患者預(yù)后相關(guān)的重要蛋白，因此PKM2、ENO1和VEGF高表達(dá)是腫瘤進(jìn)展的重要因素，同時檢測PKM2、ENO1和VEGF的表達(dá)可能與患者的預(yù)后有關(guān)〔15〕。腫瘤在生長過程中可以形成間質(zhì)反應(yīng)，主要表現(xiàn)是間質(zhì)的纖維化和炎細(xì)胞浸潤，炎細(xì)胞浸潤無特殊性，PKM2、ENO1對間質(zhì)的炎細(xì)胞形成起明顯的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而與間質(zhì)反應(yīng)密切相關(guān)〔16,17〕。VEGF可以誘導(dǎo)腫瘤間質(zhì)中CD34陽性的血管新生，為腫瘤旺熾性生長提供營養(yǎng)支持，同時也為腫瘤細(xì)胞播散提供血管通路〔18〕。PKM2在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用，與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化時Ras相關(guān)的C3肉毒底物(Rac)1的活化有關(guān)。也有研究認(rèn)為PKM2可能通過激活基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)起作用〔19〕。因此PKM2、ENO1對轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)作用途徑可能更多，尚需要更多實驗研究來證實。