基于表觀遺傳學(xué)探討消異方對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠內(nèi)膜細(xì)胞的防護機制*

周艷艷，付佳琳，雷 震

(1.河南省中醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450002； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450002； 3.河南省中醫(yī)院中心實驗室，河南 鄭州 450002)

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis, EMs)是育齡婦女的常見病,發(fā)病率10%～15%。人類對本病進行了大量的研究,用多種學(xué)說解釋本病，但迄今為止沒有任何一種學(xué)說能完全解釋EMs的所有臨床表現(xiàn)，確切的發(fā)病機制仍不清楚。近年來，研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生與發(fā)展是遺傳易感性與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果，同時伴隨著表觀遺傳學(xué)方面的改變，尤其是DNA甲基化在EMs的發(fā)病機制中得到了廣泛關(guān)注[1]。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾,DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT1、DNMT3a、Mbd2是DNA甲基化的關(guān)鍵酶。本研究以病證結(jié)合氣滯血瘀證子宮內(nèi)膜異位大鼠為研究對象，觀察消異方對大鼠EMs在位及異位內(nèi)膜組織中DNMT1、DNMT3a、Mbd2表達(dá)水平的影響，從表觀遺傳學(xué)方面探討消異方對子宮內(nèi)膜細(xì)胞的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動 物

SPF級同種未孕成年雌性8～10周齡SD大鼠120只，體質(zhì)量(200±30)g，購自河南省實驗動物中心。給予標(biāo)準(zhǔn)光照周期(14 h光照、10 h黑夜)，室內(nèi)溫度(23±2)℃，濕度40%～50%，每籠3只，予以滅菌飼料及飲用水。該實驗在河南省中醫(yī)院細(xì)胞成像中心實驗室完成。

1.2 藥品、試劑與儀器

消異方水煎劑由河南省中醫(yī)院制劑室提供。處方組成：土茯苓、土鱉蟲、土貝母、鬼箭羽、大血藤、連翹、香附、黃芪、烏藥。每劑中藥含原生藥材100 g。藥物被制成低劑量、高劑量2種水煎液, 質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1 g生藥/mL、4 g生藥/mL。散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊，0.4g/粒，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，批號Z20030127，由河南省中醫(yī)院藥房提供。反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT resgent Kit with gDNA Eraser (批號AI12361A)、TB GreenTMPremix Ex Taq II(批號AI21774A)，購自大連寶生物公司；Dnmt1、DNMT3a、Mbd2引物序列采用Primer 5在線軟件設(shè)計，并由上海生工技術(shù)有限公司合成。賽多利斯BT25S電子精密天平，德國賽多利斯公司產(chǎn)品；JW-3022HR型高速冷凍離心機，安徽嘉文儀器裝備有限公司產(chǎn)品；2400型PCR擴增儀、real-time RT-PCR儀，美國 Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 氣滯血瘀證EMs動物模型的建立

將96只SD大鼠采用自體子宮內(nèi)膜移植法造模，并于術(shù)后1周，待大鼠腹部切口基本愈合后進行氣滯血瘀證模型復(fù)制[2]：①用貼有紗布的止血鉗夾鼠尾，使之保持激怒爭斗狀態(tài)，2 min/次；②用繃帶細(xì)條束縛大鼠后肢，使之行走困難，30 min/次；③食用油10 μL/g體質(zhì)量灌胃；④以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 g/L的腎上腺素皮下注射，0.2 mL/只。每日從以上方式中隨機選擇一種進行刺激,連續(xù)4周。

1.4 分組與給藥

另取24只大鼠于清潔級環(huán)境中飼養(yǎng)，作為空白對照組。將造模成功的大鼠隨機分為模型對照組、中藥低劑量組、中藥高劑量組、散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊組4組，每組24只。散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊組灌胃給予散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊(0.05 g/mL)；中藥低劑量組(1 g/mL)、中藥高劑量組(4 g/mL)給予消異方水煎劑；空白對照組及模型對照組大鼠均給予生理鹽水，以上各組給藥容積均為1 0 μL/g，2次/d，連續(xù)28 d。

1.5 檢測指標(biāo)

在末次給藥1 d后將各組大鼠處死，快速摘取在位及異位子宮內(nèi)膜，快速凍存于-80 ℃冰箱。采用RT-PCR法檢測內(nèi)膜組織中DNMT1、DNMT3a、Mbd2的表達(dá)，嚴(yán)格按照操作說明進行實驗。PCR引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 DNMT1、DNMT3a、Mbd2在空白對照組、模型對照組中的表達(dá)水平的對比

與空白對照組正常內(nèi)膜對比，DNMT1、DNMT3a在模型對照組異位及在位內(nèi)膜呈低表達(dá)，Mbd2呈高表達(dá)，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；DNMT1、DNMT3a在模型對照組異位與在位內(nèi)膜的表達(dá)對比，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 DNMT1、DNMT3a、Mbd2在空白對照組、模型對照組中的表達(dá)的對比

注：與空白對照組對比，***P<0.01；與模型對照組異位對比，#P>0.05

2.2 消異方對EMs大鼠異位內(nèi)膜DNMT1、DNMT3a表達(dá)水平的影響

與模型對照組對比，在中藥低、高劑量組和散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊組的DNMT1、DNMT3a表達(dá)均升高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與中藥低劑量組對比，中藥高劑量組的DNMT1、DNMT3a呈高表達(dá)(P<0.05)。散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊組與中藥低劑量組的2個指標(biāo)對比，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 消異方對EMs大鼠異位內(nèi)膜DNMT1、DNMT3a表達(dá)水平的影響

注：與模型對照組對比，△△△P<0.01；與中藥低劑量組對比，＊P>0.05，＊＊P<0.05

2.3 消異方對EMs大鼠異位內(nèi)膜Mbd2表達(dá)水平的影響

與模型對照組對比，中藥低、高劑量組和散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊組的Mbd2表達(dá)均降低，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與中藥低劑量組對比，Mbd2在中藥高劑量組呈低表達(dá)(P<0.05)，Mbd2在散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊組與中藥低劑量組表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。見表4。

表4 消異方對EMs大鼠異位內(nèi)膜Mbd2表達(dá)水平的影響

注：與模型對照組對比，△△△P<0.01；與中藥低劑量組對比，*P>0.05；**P<0.05

3 討 論

子宮內(nèi)膜異位癥是育齡婦女的常見病，臨床癥狀以痛經(jīng)、不孕、慢性盆腔痛、盆腔包塊多見。該病近年來雖被大量研究，但其發(fā)病機制仍不清楚。現(xiàn)有多種學(xué)說解釋EMs的發(fā)病機制，如種植學(xué)說、體腔上皮化生學(xué)說、誘導(dǎo)學(xué)說、遺傳因素、在位內(nèi)膜決定論，以及其他(如自身免疫疾病等)，但沒有一種學(xué)說能完全解釋EMs的所有臨床表現(xiàn)。近年來，表觀遺傳學(xué)，尤其是DNA甲基化在EMs的發(fā)病機制中得到廣泛關(guān)注。人類腫瘤細(xì)胞中DNA甲基化的改變可以視為腫瘤生物標(biāo)志之一[3-4]。EMs是良性疾病，但在臨床上有類似腫瘤的生物學(xué)特性，如種植、浸潤及轉(zhuǎn)移等。且目前學(xué)術(shù)界研究發(fā)現(xiàn)[5-6]EMs可能是一種表觀遺傳學(xué)疾病。表觀遺傳修飾有DNA甲基化、組蛋白乙酰化，磷酸化等，其中DNA甲基化是最主要的一種修飾方式，為DNA復(fù)制后發(fā)生的共修飾作用。一般認(rèn)為DNA甲基化與基因的表達(dá)呈反比關(guān)系[7]。甲基化程度越高，基因的表達(dá)越低，去甲基化又可使基因的表達(dá)增強。甲基化轉(zhuǎn)移酶為DNA甲基化關(guān)鍵酶[8]。DNMT1、DNMT3a是基因甲基化的重要調(diào)節(jié)因子[9]。DNMT1定位在染色體19p13.2，其功能主要是在細(xì)胞的分裂過程中維持DNA新生鏈的甲基化狀態(tài)與形式，維持甲基化轉(zhuǎn)移酶的功能。DNMT3a定位于人染色體2p33，主要是催化DNA甲基化新生位點，在配子形成和植入后的胚胎中起建立新甲基化模式，形成甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用。此外，Mbd2是具有甲基CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白家族成員，可與組蛋白乙?；感纬蓮?fù)合體，抑制基因表達(dá)。目前認(rèn)為Mbd蛋白可以募集組蛋白去乙酰化酶到基因組上的甲基CpG富集區(qū)，從而抑制轉(zhuǎn)錄[10]。消異方中土茯苓解毒清熱、除濕通絡(luò)，土鱉蟲活血散瘀、通經(jīng)止痛，兩味藥化瘀活血、解毒通絡(luò)，共為君藥。土貝母散結(jié)解毒，鬼箭羽破血通絡(luò)、解毒消腫，大血藤散瘀止痛、清熱消腫，連翹清熱解毒、散結(jié)消腫作用，四味藥助君藥加強化瘀散結(jié)、清熱解毒之力，共為臣藥。香附具有理氣解郁、止痛調(diào)經(jīng)功效，性平，味辛、微苦、微甘，辛能散，微苦能降，微甘能和，為血中氣藥，一則行氣以助化瘀，二則用在味苦藥中防其凝滯。炙黃芪健脾益氣，能提高免疫力。方中加入辛溫之烏藥，既防諸藥苦寒凝滯氣血，又能止痛減輕癥狀。此三味藥共為佐使之藥。綜觀全方補瀉兼施，寒熱并用，標(biāo)本兼治，共奏化瘀解毒、疏肝消癰之效。

本研究結(jié)果顯示：模型對照組EMs大鼠異位及在位內(nèi)膜中DNMT1和DNMT3a的表達(dá)較空白對照組正常內(nèi)膜明顯降低，Mbd2的表達(dá)明顯升高。表明：在EMS的發(fā)生過程中，DNMT1和DNMT3a的低表達(dá)、Mbd2的高表達(dá)可能會抑制了某些類似于抑癌基因作用的基因表達(dá)，從而使得子宮內(nèi)膜獲得了增殖、遷移和定植的能力，通過這樣的機制在EMs的發(fā)病中起作用。此外，消異方的不同劑量均可以通過降低大鼠EMs內(nèi)膜組織中Mbd2的表達(dá)，增強DNMT1和DNMT3a的表達(dá)來治療EMs。EMs發(fā)生涉及到多個基因的改變,該方對其他相關(guān)基因的干預(yù)機制有待進一步研究。