不同消毒劑對毛紅椿種子的消毒效果及成苗的影響

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(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院， 南昌 330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué),江西特色林木資源培育與利用2011協(xié)同創(chuàng)新中心， 南昌 330045)

毛紅椿(Toonaciliatesvar.pubescens)別名毛紅楝,屬于楝科香椿屬，為國家二級保護(hù)瀕危物種，其木材具有“桃花新木”之美譽[1]。目前，由于開發(fā)過度、自然環(huán)境的變化以及天然更新緩慢等原因，導(dǎo)致毛紅椿分布區(qū)域總面積大幅度減少[2]。在天然林實地調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，毛紅椿在很短的時間內(nèi)會比較集中落下大量飽滿種子，土壤種子庫充足。但實際上，毛紅椿萌發(fā)的實生幼苗很少，且幼苗比較纖弱、抵抗力差。毛紅椿種子質(zhì)量較小，易霉變，不耐貯藏，常溫下種子活力不足1年，且萌發(fā)幼苗容易染病死亡，病害是導(dǎo)致毛紅椿土壤種子庫活力喪失的主要原因[3-4]。種子帶菌為病害的初侵染源，這是病害綜合治理中必須解決的問題，但我國毛紅椿種子帶菌問題研究尚未見報道。在探究種子致病微生物的危害時，需要先對種子進(jìn)行消毒處理。目前對毛紅椿種子滅菌主要采用高錳酸鉀溶液浸泡[5]或0.3%多菌靈拌種[6]，消毒效果不明顯，并且缺少消毒劑對毛紅椿種苗生長影響的研究。消毒劑在一定劑量范圍內(nèi)對植物體有一定的生長抑制或毒性，必須對其安全性進(jìn)行評價。因此，借鑒其他植物種子的消毒方法，選擇高錳酸鉀、多菌靈、次氯酸鈉[7]、硫酸銅[8]、酒精[9]等5種消毒劑對毛紅椿種子進(jìn)行消毒處理，研究不同消毒處理對毛紅椿種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，尋求最佳的種子消毒處理方案，以獲得生長良好的無菌苗，為后續(xù)的研究及人工林培育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 種 子

2015年11月采集毛紅椿蒴果，采集地點位于江西省龍南縣九連山國家級自然保護(hù)區(qū)蝦公塘保護(hù)站(海拔760 m，114°27′E，24°36′N)，母樹胸徑為62.4 cm，將蒴果置于室內(nèi)使其自然開裂，去除果殼，收集種子，于-18 ℃低溫保藏備用，種子千粒質(zhì)量為 9.164 g。

1.1.2 消毒劑

0.3%、0.5%、1.2%高錳酸鉀溶液，3%次氯酸鈉溶液，1.5%硫酸銅溶液，75%乙醇溶液，0.13%多菌靈溶液(80%多菌靈水分散粉劑用無菌水配成600倍稀釋液)。

1.2 方 法

1.2.1 種子消毒處理

用不同消毒劑對毛紅椿種子進(jìn)行不同時間的消毒，以清水浸種24 h為對照組(ck)，共計16個處理，每個處理5次重復(fù)，每個重復(fù)20粒種子。選取顆粒飽滿、健康的毛紅椿種子先用清水浸種24 h，再分別用0.3%高錳酸鉀溶液(10，30 min)、0.5%高錳酸鉀溶液(120 min)、1.2%高錳酸鉀溶液(10 min)、0.3%次氯酸鈉溶液(10，20，30 min)、1.5%硫酸銅溶液(20，30，40 min)、75%乙醇溶液(20，30，40 s)、0.13%多菌靈溶液(12，24 h)浸泡種子進(jìn)行消毒，消毒處理后的種子最后用無菌水沖洗4～5次。

表2 KMnO4溶液對毛紅椿種子發(fā)芽和幼苗生長的影響

濃度(%)時間(min)發(fā)芽指數(shù)(%)發(fā)芽勢(%)發(fā)芽率(%)根長(cm)莖長(cm)干重(mg)0(ck)0(ck)54.13±4.12a38.33±7.64a78.33±7.64b3.83±0.72a4.79±1.21a4.10±0.90a0.31058.72±8.16a41.67±12.58a90.00±5.00ab3.66±1.32a4.95±0.77a4.90±0.62a0.33056.61±2.92a38.33±5.77a93.33±2.88a3.34±1.15a4.53±0.76a4.40±0.00a0.512052.17±12.35a40.00±5.00a88.33±5.77ab3.25±1.12a5.38±0.75a5.00±0.52a1.21058.75±1.29a45.00±5.00a83.33±2.89ab3.73±0.51a4.52±1.03a4.17±0.29a

發(fā)芽盒中墊2 cm厚棉花，上鋪2張濾紙，注入蒸餾水充分濕潤，發(fā)芽盒121 ℃滅菌30 min。消毒處理后的種子在無菌操作條件下放入發(fā)芽盒，每盒20粒種子，置于25 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天記錄發(fā)芽數(shù)，觀察種子及幼苗病害發(fā)生情況，20 d后結(jié)束實驗。

1.3 數(shù)據(jù)處理分析

以胚根長出約2 mm為種子發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，從開始發(fā)芽至種子連續(xù)5 d內(nèi)不再發(fā)芽為止，統(tǒng)計種子霉變率和發(fā)芽指標(biāo)，20 d后統(tǒng)計幼苗發(fā)病率。

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和多重比較(SNK法)。

發(fā)芽率(%)=(種子發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽勢(%)=(日最高發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt)(式中：Dt為發(fā)芽日數(shù)，Gt為與Dt相對應(yīng)的每天發(fā)芽種子數(shù))；

種子霉變率(%)=(發(fā)霉種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

由于本文篇幅所限，本文從107個實驗樣本中隨機挑選10位駕駛員進(jìn)行實例分析，其他樣本的處理方式與此次相同. 選擇這10位駕駛員同一天相似時間段內(nèi)的50 km行程，按照前述評價因素集的計算方式，計算各項評價因素值如表3所示.

幼苗發(fā)病率(%)=(發(fā)病幼苗數(shù)/幼苗總數(shù))×100%。

表1 KMnO4溶液對毛紅椿種子的消毒效果

濃度(%)時間(min)種子霉變率幼苗發(fā)病率0(ck)0(ck)21.67±5.77a21.65±1.78a0.3108.33±2.89b7.43±2.68b0.3306.67±5.77b6.67±2.89b0.512011.67±2.89b5.00±0.00b1.2108.33±2.89b3.96±1.89b

注：表中同列不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。下同。

2 結(jié)果與分析

2.1 KMnO4溶液對毛紅椿種子消毒效果及對種子活力的影響

KMnO4溶液對毛紅椿種子的消毒效果及毛紅椿種子發(fā)芽和幼苗生長情況如表1和表2所示。用KMnO4溶液消毒處理的毛紅椿種子霉變率和幼苗發(fā)病率均顯著低于對照，而不同濃度KMnO4溶液消毒處理之間無顯著差異(表1)。因此，0.3% KMnO4溶液消毒10 min即可以降低種子和幼苗的發(fā)病率，增加KMnO4溶液濃度或延長消毒時間，并不能顯著提高消毒效果。

經(jīng)KMnO4溶液消毒處理的種子發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢及幼苗的根長、莖長、干重與對照無顯著差異， 0.3% KMnO4消毒處理30 min的種子發(fā)芽率顯著高于對照(p<0.05)，其它處理與對照無顯著差異。以上結(jié)果表明，KMnO4溶液處理對種子發(fā)芽和幼苗生長無抑制作用。故從消毒效果和種子活力兩方面來看，0.3% KMnO4溶液消毒30 min對毛紅椿種子有消毒效果，且能夠提高種子的發(fā)芽率，優(yōu)于KMnO4溶液的其它處理。

2.2 NaClO溶液對毛紅椿種子消毒效果及對種子活力的影響

3%NaClO溶液對毛紅椿種子的消毒效果及毛紅椿種子發(fā)芽和幼苗生長情況如表3和表4所示。3% NaClO溶液處理10 min種子霉變率與對照無顯著差異，但幼苗發(fā)病率顯著降低，增加處理時間(20，30 min)，種子霉變率和幼苗發(fā)病率顯著降低(表3)。

表3 NaClO溶液對毛紅椿種子的消毒效果

濃度(%)時間(min)種子霉變率幼苗發(fā)病率0(ck)0(ck)21.67±5.77a21.65±1.78a31020.00±2.89a9.37±3.02b32011.67±2.89b3.04±1.75c33011.67±2.89b2.89±1.67c

表4 NaClO溶液對毛紅椿種子發(fā)芽及幼苗生長的影響

濃度(%)時間(min)發(fā)芽指數(shù)(%)發(fā)芽勢(%)發(fā)芽率(%)根長(cm)莖長(cm)干重(mg)0(ck)0(ck)54.13±4.12a38.33±7.64a78.33±7.64a3.83±0.72a4.79±1.21a4.10±0.90a31054.61±6.59a46.67±2.89a80.00±2.88a3.15±0.91a4.27±1.04a3.95±0.21a32057.75±7.34a43.33±7.64a85.00±8.66a2.90±1.11a3.67±1.06a3.60±1.50a33061.67±7.55a53.33±10.41a88.32±7.63a2.67±0.43b3.35±1.29a3.50±0.70a

表6 CuSO4溶液對毛紅椿種子發(fā)芽及幼苗生長的影響

種子發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢、發(fā)芽率、幼苗莖長、干重各處理間無顯著差異，隨著處理時間的增加發(fā)芽率呈增加趨勢，而根長、莖長和干重呈降低趨勢，3%NaClO溶液浸泡30 min根長顯著低于對照(表4)。以上結(jié)果表明，NaClO溶液處理對種子發(fā)芽無抑制作用，但對幼苗生長有一定的抑制作用。故從消毒效果和種子活力兩方面來看，3%NaClO溶液浸泡20 min優(yōu)于浸泡10 min和30 min的處理。

2.3 CuSO4溶液對毛紅椿種子消毒效果的影響

1.5%CuSO4溶液對毛紅椿種子的消毒效果及毛紅椿種子發(fā)芽和幼苗生長情況如表5和表6所示。1.5%CuSO4溶液處理種子，霉變率和幼苗發(fā)病率隨處理時間的增加而下降；處理40 min，種子霉變率和幼苗發(fā)病率均顯著低于對照。

表5 CuSO4溶液對毛紅椿的種子的消毒效果

種子發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢、發(fā)芽率均隨處理時間增加而呈上升趨勢，且40 min處理的種子發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢顯著高于對照(p<0.05)；萌發(fā)幼苗的根長、莖長和干重隨處理時間增加而下降。以上結(jié)果表明，1.5%CuSO4溶液浸泡種子能提高種子的發(fā)芽活力，但對幼苗根和莖的生長有輕微抑制作用。從消毒效果和種子活力兩方面來看，1.5%CuSO4溶液浸泡40 min優(yōu)于浸泡20 min和30 min的處理。

2.4 C2H5OH溶液對毛紅椿種子消毒效果的影響

75%C2H5OH溶液對毛紅椿種子的消毒效果及毛紅椿種子發(fā)芽和幼苗生長情況如表7和表8所示。75%C2H5OH溶液40 s處理，種子霉變率和幼苗發(fā)病率顯著低于對照(表7)。

表7 C2H5OH溶液對毛紅椿種子的消毒效果

濃度(%)時間(s)種子霉變率幼苗發(fā)病率0(ck)0(ck)21.67±5.77a21.65±1.78a752018.33±5.77a24.06±8.78a753020.67±2.89a26.65±4.94a75406.67±2.89b6.67±2.89b

75%C2H5OH溶液處理種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率及幼苗根長、莖長、干重均與對照無顯著差異，但發(fā)芽勢、發(fā)芽率隨著處理時間增加而降低，75%C2H5OH溶液40 s處理種子發(fā)芽指數(shù)顯著低于對照(表8)。以上結(jié)果表明，75%C2H5OH溶液對毛紅椿種子的發(fā)芽活力有一定的抑制作用，延長消毒時間(40 s以上)對種子活力不利。故從消毒效果和種子活力兩方面來看，75%C2H5OH溶液浸泡40 s優(yōu)于浸泡20 s和30 s的處理。

2.5 多菌靈對毛紅椿種子活力的影響

0.13%多菌靈溶液對毛紅椿種子的消毒效果及毛紅椿種子發(fā)芽和幼苗生長情況如表9和表10所示。0.13%多菌靈處理種子發(fā)霉率和幼苗染病率顯著低于對照，處理12 h和24 h之間無顯著差異(表9)。

0.13%多菌靈溶液浸泡12 h處理的種子發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢和發(fā)芽率最高，發(fā)芽勢與對照存在顯著差異，發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽率與其它處理不存在顯著差異；各處理間幼苗根長、莖長、干重不存在顯著差異，莖長隨處理時間增加呈增長趨勢(表10)。綜上所述，0.13%多菌靈溶液浸泡對毛紅椿種子活力有促進(jìn)作用，對幼苗生長無抑制作用。故從消毒效果和種子活力兩方面來看，0.13%多菌靈溶液浸泡12 h優(yōu)于浸泡24 h。

表10 多菌靈溶液對毛紅椿種子發(fā)芽及幼苗生長的影響

濃度(%)時間(h)發(fā)芽指數(shù)(%)發(fā)芽勢(%)發(fā)芽率(%)根長(cm)莖長(cm)干重(mg)0(ck)0(ck)54.13±4.12a38.33±7.64b78.33±7.64a3.83±0.72a4.79±1.21a4.10±0.90a0.131264.83±9.75a78.33±18.93a90.00±8.66a3.74±0.54a4.84±0.85a4.73±0.15a0.132454.31±5.39a43.33±12.58b85.00±8.67a3.36±0.68a5.15±0.73a4.36±0.73a

表11 5種消毒方案對毛紅椿種子的消毒效果及種苗生長的影響

消毒方案種子發(fā)芽率幼苗發(fā)病率幼苗干重ck78.33±7.64b21.65±1.78a4.10±0.90a0.3% KMnO4溶液浸泡30min93.33±2.88a6.67±2.89b4.40±0.00a3%NaClO溶液浸泡20min85.00±8.66ab3.04±1.75b3.60±1.50a1.5%CuSO4溶液浸泡40min88.33±7.64ab7.44±2.69b3.50±1.00a70%C2H5OH溶液浸泡40s67.50±3.53b6.67±2.89b3.95±1.48a0.13%多菌靈溶液浸泡12h90.00±8.66ab4.78±2.89b4.73±0.15a

表8 C2H5OH對毛紅椿種子發(fā)芽及幼苗生長的影響

濃度(%)時間(s)發(fā)芽指數(shù)(%)發(fā)芽勢(%)發(fā)芽率(%)根長(cm)莖長(cm)干重(mg)0(ck)0(ck)54.13±4.12a38.33±7.64a78.33±7.64a3.83±0.72a4.79±1.21a4.10±0.90a752048.72±8.19ab35.00±10.20a70.50±3.53a3.75±1.38a4.27±1.20a4.15±0.12a753044.80±8.87ab33.66±8.40a68.00±7.07a3.49±1.43a4.67±1.48a3.96±1.27a754043.50±5.50b28.33±6.30a67.50±3.53a3.36±1.66a4.42±0.93a3.95±1.48a

表9 多菌靈溶液對毛紅椿種子的消毒效果

濃度(%)時間(h)種子霉變率幼苗發(fā)病率0(ck)0(ck)21.67±5.77a21.65±1.78a0.13123.33±2.89b4.78±2.89b0.13241.67±2.89b4.30±2.89b

2.6 5種相對較優(yōu)消毒方案的比較

以種子發(fā)芽率、幼苗染病率和幼苗干重對以上5種消毒劑的相對較優(yōu)方案(0.3%KMnO4浸泡30 min；3%NaClO浸泡20 min；1.5%CuSO4溶液浸泡40 min；70%C2H5OH溶液浸泡40 s ；0.13%多菌靈溶液浸泡12 h)進(jìn)行多重比較，結(jié)果表明5種消毒方案之間幼苗染病率和幼苗干重?zé)o顯著性差異，0.3%KMnO4溶液浸泡30 min和0.13%多菌靈溶液浸泡12 h種子發(fā)芽率和幼苗干重均高于對照，處理方案相對較優(yōu)。

3 結(jié)論與討論

高錳酸鉀為強氧化劑，其溶液具有很強的殺菌消毒及防腐作用，并且安全、無毒，是很好的蔬菜類種子的消毒劑[10]，本試驗也同樣證明了高錳酸鉀對毛紅椿種子具殺菌消毒效果，且對毛紅椿幼苗生長無抑制作用。0.3%高錳酸鉀溶液消毒處理能顯著促進(jìn)毛紅椿種子萌發(fā)，與張麗等[4]研究結(jié)果一致。

次氯酸鈉溶液具有強氧化性和腐蝕性，在煙草[11]、大豆[12]、黃連木[13]等種子消毒過程中的效果較好，采用的濃度范圍在2%～30%之間，不同植物種子對其耐受能力存在差異。例如：30%NaClO處理煙草種子30 min，消毒效果較好，發(fā)芽率最高[14]； 10%NaClO溶液對頭花蓼種子消毒可以獲得無菌苗，但發(fā)芽率顯著降低[15]。 本試驗結(jié)果表明，3%NaClO浸泡毛紅椿種子30 min對種子發(fā)芽無顯著影響，幼苗發(fā)病率降低86.7%，但消毒后種皮有破損現(xiàn)象，對幼苗的生長有一定的抑制作用。

硫酸銅主要毒性機理是銅離子與蛋白質(zhì)結(jié)合后生成絡(luò)合物，使蛋白質(zhì)變性、沉淀，從而改變酶活性乃至失活。彭健等研究表明，1.5%CuSO4溶液浸種10 min，種子霉變率降低84%，且能顯著提高種子活力[16]。徐亞莉等研究表明，0.05～1.50 mmol/L硫酸銅處理對莧菜種子發(fā)芽率無顯著影響，但其胚根和下胚軸的伸長受到了抑制，種子活力指數(shù)急劇下降[17]。本研究表明，1.5%CuSO4溶液浸種40 min，毛紅椿種子霉變率和幼苗發(fā)病率均降低，顯著提高了種子活力，但對幼苗生長有一定的抑制作用。

研究表明，用75%乙醇預(yù)處理，可降低種子帶菌率[9,11]。本試驗表明，75%乙醇處理種子40 s對毛紅椿種子具有消毒效果，但種子活力有所下降，幼苗生長也受到抑制。

多菌靈為苯并咪唑類殺菌劑，是低毒性的內(nèi)吸式農(nóng)用真菌抑菌劑，其作用機理主要是干擾真菌的有絲分裂中紡錘體的形成，影響細(xì)胞分裂，孢子萌發(fā)長出畸形的芽管，起到殺菌作用[19]。趙雙雙等研究表明，添加0.05%濃度的多菌靈可使白及種子母瓶污染率從30%降低至2%，但多菌靈0.05%以上濃度對白及小苗生長抑制較為明顯[19]。本研究表明，0.13%多菌靈溶液浸泡12 h，毛紅椿種子霉變率和幼苗發(fā)病率顯著降低，提高了種子發(fā)芽率，對幼苗生長沒有影響。

毛紅椿種子種源不同或因保藏溫度和時間的不同，種子帶菌數(shù)量和種類會發(fā)生變化，消毒劑的消毒效果也會改變。本試驗中選擇的是健康、顆粒飽滿的毛紅椿種子，所以發(fā)芽率較高，病害率較低。結(jié)果表明，不同的消毒處理方案并不能殺死所有的有害菌，消毒后種子及幼苗仍有病害發(fā)生，主要是長霉，即真菌感染。幼苗的發(fā)病特征主要為尖腐和根腐2種。由于提高以上消毒劑濃度和作用時間對種子萌發(fā)及幼苗生長的抑制作用或消毒效果的有限性，要得到無菌苗或進(jìn)一步提高消毒效果，有必要分離鑒定病害真菌，有針對性地進(jìn)行研究。

通過比較得出以下結(jié)論：5種消毒劑對毛紅椿種子都有消毒效果，綜合考慮對毛紅椿種子萌發(fā)和幼苗生長的影響認(rèn)為，0.3%KMnO4溶液浸泡30 min或0.13%多菌靈溶液浸泡12 h為毛紅椿種子比較好的消毒方案。