腸道病毒5′-非翻譯區(qū)測(cè)序分型的應(yīng)用評(píng)估

唐詩(shī)歡 謝爭(zhēng)華 劉朵朵 袁穎 陳滿君 范笑地 丁細(xì)霞 余楠

510282廣州,南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部廣東省突發(fā)傳染病病原微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

腸道病毒(enterovirus，EV)屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，有12個(gè)種(A-L)，150多個(gè)血清型[1]。EV是常見病原體，引起手足口病、腦炎和呼吸系統(tǒng)疾病等，不同血清型導(dǎo)致的疾病有所區(qū)別[2]。除國(guó)內(nèi)主要流行的腸道病毒A組71型(EVA71)、柯薩奇病毒A組16型(cosackievirus A group 16，CoxA16)和6型(CoxA6)，以及引起呼吸道感染的腸道病毒D組68型(enterovirus D68，EVD68)外，其他血清型EV的感染情況、疾病特征、預(yù)后等，相關(guān)資料較少。EV血清型鑒定目前主要用于流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，臨床實(shí)驗(yàn)室較少開展。

EV基因組為單股正鏈RNA，其中5’-非翻譯區(qū)(5′-untranslated region，5′-UTR)基因序列高度保守，適合作檢測(cè)靶標(biāo)，用于EV初篩。衣殼蛋白 VP1(viral protein 1)、VP2、VP4決定了 EV 的抗原性，用于血清型分型[3-5]，其中VP1區(qū)分型與血清型完全對(duì)應(yīng)，被認(rèn)為是最準(zhǔn)確的分型靶標(biāo)[6]。一般無需病毒分離，可采用巢式逆轉(zhuǎn)錄PCR直接擴(kuò)增、測(cè)序標(biāo)本的病毒VP1區(qū)，缺點(diǎn)是操作繁瑣，敏感度低，檢出率約60%[7-8]。有學(xué)者認(rèn)為5′-UTR對(duì)血清型區(qū)分有一定價(jià)值[9-10]，雖非分型首選方法，但敏感度高。5′-UTR分型對(duì)于國(guó)內(nèi)流行的主要EV血清型的適用程度如何，目前較全面的評(píng)價(jià)資料不多。本研究利用近年確認(rèn)的EV感染者呼吸道、腸道的臨床標(biāo)本600余例，比較5′-UTR與VP1區(qū)測(cè)序分型以及型特異性VP1區(qū) RT-PCR檢測(cè)結(jié)果，評(píng)價(jià)5′-UTR分型的性能，為其應(yīng)用于EV血清型相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本 拭子采自就診于南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院的有發(fā)熱、出疹(手足皰疹、口腔潰瘍等)、呼吸道癥狀(咳嗽、流涕、呼吸急促等)、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀(抽搐、驚厥、肌痙攣、昏迷等)等疑似EV感染的病例。采集后立即冰盒送至實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存?zhèn)溆谩?016年1月到2017年12月采集肛拭769份，2014年1月到2017年12月采集鼻拭2 416份，標(biāo)本采集征得患者知情同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 核酸提取:采用 Viral RNA Mini Kits(Qiagen，德國(guó))，按說明書操作。

1.2.2 EV初篩:采用EV通用型熒光定量PCR試劑(之江，中國(guó))，篩查為陽性的標(biāo)本納入研究。按試劑盒說明操作和判斷結(jié)果。

1.2.3 以5′-UTR區(qū)擴(kuò)增比對(duì)分型(簡(jiǎn)稱5′-UTR法):引物及反應(yīng)條件來自文獻(xiàn)[10-11]。

1.2.4 以VP1區(qū)擴(kuò)增比對(duì)分型(簡(jiǎn)稱VP1法):引物及反應(yīng)條件來自文獻(xiàn)[12]。

1.2.5 型特異性 RT-PCR:EVA71、CoxA16、CoxA6和CoxA10分別采用型特異性熒光定量PCR試劑盒，按說明操作。EVD68特異性巢式PCR引物及反應(yīng)條件來自文獻(xiàn)[13]。

1.2.6 測(cè)序分型:生工生物工程(上海)公司測(cè)序，序列在GenBank上比對(duì)，根據(jù)比對(duì)同源性的高低獲得腸道病毒血清型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件。采用2×2表格(對(duì)照方法/研究方法)分別計(jì)算靈敏性、特異性，卡方檢驗(yàn)進(jìn)行兩個(gè)率的比較，kappa檢驗(yàn)分析方法一致性。

2 結(jié)果

2.1 不同標(biāo)本類型EV分型 769例肛拭和2 416例鼻拭經(jīng)EV通用型核酸篩查為陽性的共有666例，分別是518例肛拭(陽性率67.4%)和148例鼻拭(陽性率6.1%)。進(jìn)一步EV分型:5′-UTR法成功553例，VP1法成功318例 (83.0%Vs 47.7%，P＜0.001)。518例肛拭中，5′-UTR法分型成功434例，VP1法274例(83.8%Vs 52.9%，P＜0.001)；148例鼻拭中，5′-UTR法分型成功119例，VP1法44例(80.4%Vs 29.7%，P＜0.001)。

肛拭(VP1/5′-UTR至少1種)檢出最多的5種血清型分別為:CoxA6(217/518，41.9%)、CoxA16(88/518，17.0%)、EVA71(40/518，7.7%)、CoxA10(28/518，5.4%)和 CoxA4(27/518，5.2%)；鼻拭檢出率最高的血清型為EVD68(15/148，10.1%)。由于兩種方法對(duì)部分鼻拭中的EV僅能區(qū)分為鼻病毒A、B、C組，故不再分析對(duì)鼻病毒血清型的分型性能。

2.2 以VP1法為對(duì)照的5′-UTR法分型性能評(píng)估以VP1法為參考，5′-UTR法對(duì)不同血清型的分型性能有差別。肛拭主要檢出的5種血清型中，5′-UTR法對(duì)CoxA6、EVA71和CoxA10的靈敏性較好(91.3～93.3%)，CoxA4較差(70.6%)，CoxA16最差(57.1%)；對(duì)EVA71、CoxA10和CoxA4的特異性很好(97.4% ～98.1%)，CoxA6和 CoxA16其次(84.3% ～86.5%)；兩種分型方法對(duì) EVA71和CoxA6一致性較好(kappa值 0.706～0.847)，CoxA10和 CoxA4一般(0.601～0.654)，CoxA16最差(kappa值0.188)。 對(duì)于鼻拭檢出的 EVD68，5′-UTR法靈敏性為100.0%，特異性為91.1%，但兩種方法一致性差(kappa值0.217)，見表1。

2.3 以VP1法結(jié)合型特異性RT-PCR為對(duì)照的5′-UTR法分型性能評(píng)估 對(duì)5′-UTR法分型陽性而VP1法陰性的標(biāo)本，進(jìn)一步采用型特異性RT-PCR驗(yàn)證，分別有 CoxA6(51/56)、CoxA16(41/67)、EVA71(6/9)、CoxA10(13/13)和 EVD68(10/13)得以確認(rèn)。以VP1法結(jié)合型特異性RT-PCR為參考，5′-UTR法對(duì)上述血清型的靈敏性分別提高為:93.4%、85.5%、97.2%、96.4%和100.0%，特異性提高為98.4%、94.3%、99.4%、100.0%和97.8%，兩種方法一致性好(kappa值0.713～0.981)，見表2。

表1 腸道病毒5′-UTR分型的診斷性能Tab.1 Diagnostic performance of 5′-UTR serotyping for EV compared with VP1 serotyping

表2 對(duì)照腸道病毒VP1區(qū)分型和型特異性RT-PCR的5′-UTR分型性能Tab.2 Diagnostic performance of 5′-UTR serotyping for EV

3 討論

我國(guó)EV感染人數(shù)居高不下，僅手足口病，2012年至2017年，年報(bào)告達(dá)182.8萬 ～277.9萬例。CoxA16和 EVA71為常見的血清型，近年 CoxA6、CoxA10出現(xiàn)增多趨勢(shì)[14-15]。曾在歐美引起嚴(yán)重呼吸和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的EVD68，近年也在亞洲多個(gè)地區(qū)有所報(bào)道[13，16-17]。不同血清型EV引起的疾病有差別，各型間無交叉免疫力，因此，準(zhǔn)確、高效的EV血清型鑒定不論對(duì)臨床診治還是疾控監(jiān)測(cè)，均有意義。

傳統(tǒng)的EV血清型鑒定依賴病毒分離及中和試驗(yàn)，方法耗時(shí)、昂貴。VP1蛋白包含主要的中和抗原決定簇，序列可用于血清型鑒定，但針對(duì)VP1區(qū)的簡(jiǎn)并引物難適應(yīng)復(fù)雜變異，擴(kuò)增效率低，不同血清型檢出率差異大[18]。5′-UTR分型具一定敏感度和特異性[9]，Ge等人[9]以型特異性RT-PCR為對(duì)照，采用5′-UTR分型方法檢測(cè)了4種血清型、40份臨床樣本，認(rèn)為分型結(jié)果可接受。該法對(duì)我國(guó)近年EV流行株分型性能的評(píng)價(jià)資料有限，本研究納入近四年的臨床樣本，涵蓋更多血清型，評(píng)價(jià)可更客觀。

針對(duì)5′-UTR 設(shè)計(jì)的方法有多種[9，11]，本研究所用方法最早用于鼻病毒分型[10]，后有學(xué)者將其應(yīng)用于EV分型，也有較好效果且操作簡(jiǎn)便[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，除 CoxA16外，該法對(duì) CoxA6、EVA71、CoxA10和EVD68等幾種主要血清型的分型能力較好。VP1分型方法也有多種，本研究采用的方法[12]自2006年發(fā)表以來，為全世界眾多實(shí)驗(yàn)室采用，本實(shí)驗(yàn)室前期也小樣本量比較了幾種類似方法，因該法成功率略高而沿用。

對(duì)于兩種樣本類型，5′-UTR法的分型成功率均較VP1法高。影響分型效果的主要是方法設(shè)計(jì)，如簡(jiǎn)并引物對(duì)目標(biāo)區(qū)域的匹配度、不適應(yīng)復(fù)雜變異等，其次可能與病毒載量有關(guān)。Kiang等[10]以VP4/VP2分型為參考，考評(píng)5’-UTR分型，發(fā)現(xiàn)兩種方法對(duì)病毒液的分型成功率高且一致性好，對(duì)臨床標(biāo)本則VP4/VP2擴(kuò)增效率很低，而5’-UTR能成功擴(kuò)增分型，推測(cè)與病毒載量有關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)即使同一標(biāo)本，兩種方法擴(kuò)增亦有差別。

為確認(rèn)5′-UTR法診斷陽性而VP1法診斷陰性的這部分結(jié)果源自前者的非特異性還是后者的低敏感度，本研究采用型特異性RT-PCR鑒定，分析顯示各血清型EV的診斷敏感度和特異度均有提高，提示兩種方法不一致主要是VP1法低敏感度低導(dǎo)致。CoxA4由于例數(shù)較少，未對(duì)該型進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上，5′-UTR法對(duì)EV血清型的診斷效果尚可。即使樣本來自同一部位，如肛拭，其對(duì)不同血清型EV的診斷性能也有差異，因此應(yīng)用時(shí)，應(yīng)根據(jù)研究目的綜合考慮。對(duì)于臨床感染病例的研究，可考慮5′-UTR初步分型加型特異性RT-PCR確認(rèn)的思路。

利益沖突 無