多重?zé)晒舛縋CR方法在呼吸道合胞病毒和腺病毒檢測中的Meta分析

趙莉 李貴霞 趙民 王佶 張瑞卿 馮志山 馬學(xué)軍

050031石家莊,河北醫(yī)科大學(xué)(趙莉、張瑞卿);050031石家莊,河北省兒童醫(yī)院(李貴霞、馮志山);053500景縣,河北省景縣人民醫(yī)院(趙民);102206北京,中國疾病預(yù)防控制中心病毒病所(王佶、張瑞卿、馬學(xué)軍)

呼吸道感染是一類常見的疾病，80%以上病例由病毒引起，它在嬰幼兒、兒童、老年人、免疫力低下的人群中有極高的發(fā)病率和死亡率[1-3]。引起呼吸道感染的常見病毒主要有呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)、腺病毒(adenovirus，ADV)、副流感病毒(parainfluenza virus，PIV)、人鼻病毒(human rhinovirus，HRV)、流感病毒(influenza virus，IFV)[1，4]，其中 RSV 和 ADV 分別是呼吸道RNA病毒和DNA病毒中較常見的病毒[5]。

近些年來，分子生物學(xué)檢測技術(shù)不斷發(fā)展，其中實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)具有高靈敏度、高特異性且操作簡便等優(yōu)點(diǎn)[6]，多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR(multiplex real time polymerase chain reaction，MRTPCR)技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)高通量檢測，在qRT-PCR優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上又節(jié)省了成本、減少了工作量[7]。為科學(xué)評(píng)價(jià)MRT-PCR方法檢測呼吸道病毒的價(jià)值，為臨床應(yīng)用提供參考，本研究對(duì)MRT-PCR檢測呼吸道感染中常見的RNA病毒(RSV)和DNA病毒(ADV)進(jìn)行了Meta分析。

1 材料與方法

1.1 文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn) 文獻(xiàn)的納入標(biāo)準(zhǔn):(1)研究類型為診斷性研究。(2)研究目的為評(píng)價(jià)MRT-PCR方法對(duì)呼吸道病毒的診斷價(jià)值。(3)中文和英文文獻(xiàn)。(4)文獻(xiàn)能直接或間接提供原始數(shù)據(jù)獲得四表格數(shù)據(jù):真陽性值(true positive，TP)、假陽性值(false positive，F(xiàn)P)、假陰性值(false negative，F(xiàn)N)、 真陰性值(true negative，TN)。 排除標(biāo)準(zhǔn):(1)重復(fù)發(fā)表的文章。(2)無全文的文章。(3)用MRT-PCR方法作為唯一的參考標(biāo)準(zhǔn)去評(píng)估其它的MRT-PCR的文章。(4)研究例數(shù)＜30例。(5)重要數(shù)據(jù)報(bào)告缺失。除此之外，我們排除學(xué)位論文、文摘、綜述、講座和述評(píng)類文獻(xiàn)。

1.2 檢索策略 計(jì)算機(jī)檢索美國國立醫(yī)學(xué)圖書館PubMed數(shù)據(jù)庫、荷蘭醫(yī)學(xué)文摘 EMBASE數(shù)據(jù)庫、Cochrane臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)庫、萬方數(shù)據(jù)庫、CNKI數(shù)字圖書館。檢索時(shí)間限定為2010年1月至2018年1月。 英文檢索詞包括:multiplex，real time，quantitative，pcr，polymerase chain reaction，respiratory virus，respiratory tract infection， respiratory infection，respiratory tract disease， respiratory disease， common cold， influenza， pneumonia， bronchitis， bronchiolitis，rhinosinusitis， pharyngitis， laryngitis， otitis media，tonsillitis， asthma， copd， chronic obstructive lung disease。中文檢索詞包括:多重?zé)晒舛縋CR，呼吸道病毒。

1.3 文獻(xiàn)篩選、數(shù)據(jù)提取和質(zhì)量評(píng)價(jià) 由本研究中的兩名人員分別獨(dú)立提取數(shù)據(jù)，如出現(xiàn)意見不一致時(shí)，征求第三方專家解決。所有文獻(xiàn)信息錄入Excel數(shù)據(jù)庫，錄入信息包括:作者、發(fā)表年、國家、研究例數(shù)、年齡范圍、呼吸道病毒檢測的參照方法、計(jì)算靈敏度、特異度所需的四格表數(shù)據(jù)，納入文獻(xiàn)的檢測限。采用診斷準(zhǔn)確性研究的質(zhì)量評(píng)價(jià)工具QUADAS-2[8](quality assessment of diagnostic accuracy studies-2)對(duì)所納入研究的方法學(xué)質(zhì)量及偏倚風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，包括病例的選擇、待評(píng)價(jià)試驗(yàn)、金標(biāo)準(zhǔn)、病例流程和進(jìn)展情況4部分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究采用Meta-Disc1.4軟件進(jìn)行異質(zhì)性檢驗(yàn)和合并統(tǒng)計(jì)量分析，使用Stata 12.0軟件進(jìn)行發(fā)表偏倚檢測。首先采用spearman相關(guān)分析檢測有無閾值效應(yīng)的存在。進(jìn)而用I2評(píng)估所納入原始研究間的異質(zhì)性。當(dāng)P＞0.1，I2≤50%(I2反映了研究間變異占總變異的百分比)時(shí)采用固定效應(yīng)模型，否則認(rèn)為存在異質(zhì)性，采用隨機(jī)效應(yīng)模型對(duì)各診斷指標(biāo)進(jìn)行匯總處理。診斷評(píng)價(jià)指標(biāo)主要包括:敏感度(sensitivity，sen)、特異度(specificity，spe)、陽性似然比(positive likelihood ratio， +LR)、陰性似然比(negative likelihood ratio，-LR)、診斷優(yōu)勢比(diagnostic odds ratio，DOR)、綜合受試者工作特征(summary receiver operating characteristics，SROC)曲線下面積(area under curve，AUC)和 Q指數(shù)，同時(shí)計(jì)算相應(yīng)的95%CI值。發(fā)表偏倚采用Deek檢驗(yàn)完成。檢驗(yàn)水準(zhǔn)均設(shè)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)檢索結(jié)果 根據(jù)指定的檢索策略共獲得相關(guān)文獻(xiàn)2 113篇，經(jīng)逐層篩選，按照排除標(biāo)準(zhǔn)排除不符合要求的文獻(xiàn)，最終獲得10篇評(píng)估MRT-PCR方法檢測呼吸道合胞病毒和腺病毒感染的診斷價(jià)值的文獻(xiàn)，共包括病例2 528例。文獻(xiàn)的篩選流程和結(jié)果見圖1。

圖1 文獻(xiàn)篩選流程圖Fig.1 Flow diagram of the literature search

表1 納入文獻(xiàn)的基本信息Tab.1 Characteristics of 10 included studies

2.2 納入研究的基本特征和偏倚風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估 納入的10篇文獻(xiàn)中，納入研究的基本特征見表1。本研究采用QUADAS-2工具進(jìn)行偏移風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示主要風(fēng)險(xiǎn)來源于病例的選擇部分，待評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)、金標(biāo)準(zhǔn)、病例流程和進(jìn)展情況大部分是低風(fēng)險(xiǎn)偏倚。

2.3 Meta分析結(jié)果

2.3.1 異質(zhì)性檢驗(yàn):MRT-PCR檢測RSV閾值效應(yīng)檢驗(yàn)結(jié)果為:計(jì)算靈敏度對(duì)數(shù)與 (1-特異度)對(duì)數(shù)的spearman相關(guān)系數(shù) =0.596(P=0.069)；Meta-Disc1.4軟件擬合的ROC曲線不呈“肩背狀”，提示尚不能認(rèn)為存在閾值效應(yīng)。研究間敏感性和特異性的異質(zhì)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示P=0.00，I2=85.1%；P=0.00，I2=90.1%。納入的MRT-PCR檢測RSV的研究結(jié)果間存在異質(zhì)性，且并非閾值效應(yīng)引起。MRTPCR檢測ADV閾值效應(yīng)檢驗(yàn)結(jié)果為:spearman相關(guān)系數(shù)=0.071(P=0.867)；Meta-Disc1.4軟件擬合的ROC曲線不呈“肩背狀”，提示尚不能認(rèn)為存在閾值效應(yīng)。研究間敏感性和特異性的異質(zhì)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示 P=0.00，I2=74.6%；P=0.00，I2=80.3%。 納入的多重?zé)晒舛縋CR檢測ADV的研究結(jié)果間存在異質(zhì)性，且并非閾值效應(yīng)引起。因此多重?zé)晒舛縋CR檢測RSV和ADV感染均采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行合并統(tǒng)計(jì)量分析。

2.3.2 合并效應(yīng)量結(jié)果:隨機(jī)效應(yīng)模型Meta分析結(jié)果顯示:MRT-PCR檢測 RSV的 Sen合并，Spe合并，+LR合并，-LR合并分別為0.87(95%CI:0.83-0.90)、0.98(95%CI:0.97-0.98)、64.05(95%CI:18.84-217.68)、0.12(95% CI:0.05-0.26)， 見 圖 2。DOR合并、AUC和 Q指數(shù)分別為919.76(95%CI:432.74-1954.89)、1.00 和 0.97。 MRT-PCR 檢測ADV 的 Sen合并， Spe合并， +LR合并， -LR合并分別為0.64(95%CI:0.56-0.71)、0.99(95% CI:0.98-0.99)、107.16(95%CI:24.28-472.95)、0.19(95%CI:0.07-0.50)，見圖3。 DOR合并、AUC和 Q 指數(shù)分別為 596.29(95% CI:222.77-1596.09)、0.99和0.96。

圖2 MRT-PCR 檢測 RSV 的 Sen合并(A)、Spe合并(B)、+LR合并(C)、-LR合并(D) 森林圖Fig.2 Forest plot of total sensitivity(A)， total specificity(B)，total+LR(C)，total-LR(D)of MRT-PCR for detection of RSV

2.4 敏感性分析 敏感性分析通過逐一剔除研究例數(shù)較少的幾篇文獻(xiàn)，重新計(jì)算各合并統(tǒng)計(jì)量。結(jié)果顯示，Sen合并、Spe合并、AUC 的改變都非常小，可以認(rèn)為本研究結(jié)果穩(wěn)定性較好。

2.5 發(fā)表偏倚分析 采用Stata12.0軟件繪制Deek漏斗圖，評(píng)估納入研究的發(fā)表偏倚。對(duì)RSV和ADV進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果分別為t=-1.12，P=0.30；t=-0.06，P=0.95，P 值均大于 0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示存在發(fā)表偏倚的可能性較小。

圖3 MRT-PCR檢測 ADV 的 Sen合并(A)、Spe合并(B)、+LR合并(C)、-LR合并(D) 森林圖Fig.3 Forest plot of total sensitivity(A)，total specificity(B)，total+LR(C)，total-LR(D)of MRT-PCR for detection of ADV

3 討論

本研究共納入2 528例病例樣本，Meta分析結(jié)果顯示MRT-PCR檢測RSV的Sen合并和Spe合并分別為0.87和0.98，表明其在檢測RSV中具有較高的特異度，但靈敏度有待進(jìn)一步提高。通常+LR大于10或-LR小于0.1可以作為確定或排除疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)(確診診斷)[17]。本研究中，MRT-PCR檢測RSV的 +LR合并是64.5，表明 MRT-PCR對(duì) RSV的誤檢率較低；-LR合并是0.12，表明在檢測RSV為陰性時(shí)尚不能排除RSV為陽性的病例，提示不能排除漏檢情況。本研究檢測RSV的AUC和Q指標(biāo)分別為1.00和0.97，AUC和Q指標(biāo)都是同時(shí)考慮了靈敏度和特異度的綜合指標(biāo)，提示 MRT-PCR檢測RSV的綜合能力較好。DOR也是綜合反映靈敏度和特異度的診斷效能指標(biāo)，本研究中該值為919.76，說明MRT-PCR對(duì)RSV具有較好的檢測能力。總之，MRT-PCR檢測RSV的靈敏度有待進(jìn)一步提高，檢測綜合能力較好。MRT-PCR檢測ADV的 Sen合并和Spe合并分別為0.64 和0.99，+LR合并和-LR合并分別為107.16和0.19，AUC為0.99，Q 指數(shù)為 0.96，DOR合并為 596.29。 提示 MRT-PCR 檢測ADV有極高的特異度，但靈敏度中等，誤檢率較低，漏檢情況不能排除，但MRT-PCR檢測ADV感染的綜合能力較好。

綜合來看，MRT-PCR檢測呼吸道常見RNA病毒RSV和DNA病毒ADV感染的綜合能力較好，但是其對(duì)RSV和ADV的漏檢情況尚不能排除，靈敏度還有待進(jìn)一步提高。通過將多種呼吸道病毒的引物和探針或者引物和熒光染料放到一管里進(jìn)行檢測，可能對(duì)其檢測的靈敏度產(chǎn)生影響；此外本研究納入的文獻(xiàn)檢測RSV和ADV的引物不完全相同，導(dǎo)致報(bào)道的檢測靈敏度有差異。因此，MRT-PCR在檢測呼吸道病毒感染時(shí)，其靈敏度還可以改善，但檢測的綜合能力較好。

本研究尚存在一些不足，首先，選擇的文獻(xiàn)都是公開發(fā)表的全文，未列入灰色文獻(xiàn)，可能有一定的偏倚；其次，本研究結(jié)果存在一定的異質(zhì)性，但由于納入文獻(xiàn)篇目有限未進(jìn)行亞組分析；另外，納入文獻(xiàn)中評(píng)價(jià)MRT-PCR的參考方法存在一定差異，可能對(duì)評(píng)價(jià)結(jié)果有些影響；最后，本研究僅對(duì)呼吸道病毒感染較常見的RSV和ADV做了評(píng)價(jià)，在以后的工作中，將會(huì)進(jìn)一步評(píng)價(jià)MRT-PCR對(duì)其他呼吸道病毒的檢測效能。

總之，根據(jù)本研究結(jié)果，MRT-PCR對(duì)呼吸道常見病毒RSV和ADV的檢測具有較高的特異度，對(duì)RSV和ADV的檢測靈敏度還有待進(jìn)一步提高，但MRT-PCR檢測RSV和ADV的綜合能力較好，值得推薦用于臨床早期診斷呼吸道病毒RSV和ADV的感染。

利益沖突 無