山柰酚對(duì)缺血性腦損傷大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用研究

鄭紅麗， 李廣生

腦血管疾病是威脅人類健康的常見病、多發(fā)病，其中缺血性腦血管病發(fā)病率高達(dá)85%。缺血性腦損傷是由于腦血流障礙引起的腦組織局部缺血壞死，其發(fā)病機(jī)制涉及腦組織能量代謝、興奮性氨基酸毒性、自由基或炎癥損傷、鈣超載、神經(jīng)細(xì)胞凋亡等多個(gè)環(huán)節(jié)[1]。山柰酚(Kaempferol)是一種從姜科植物山柰以及檀香科植物百蕊草中所提取的黃酮類化合物,廣泛存在于各種蔬菜和水果中，具有抗腫瘤、抗炎和抗氧化等多種藥理作用[2～4]。近年來研究表明,山柰酚的抗炎作用對(duì)急性肺損傷、乳腺炎和關(guān)節(jié)炎等疾病有積極的治療效果[5]。然而，目前關(guān)于山柰酚在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的研究，尤其是對(duì)缺血性腦損傷的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道較少。因此，本研究通過建立腦缺血再灌注大鼠模型，觀察山柰酚對(duì)腦組織炎癥反應(yīng)和腦缺血損傷相關(guān)凋亡蛋白的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而探討山柰酚在大鼠腦缺血性再灌注損傷中是否會(huì)起神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年SD大鼠50只，雄性，體重250～300 g，購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK(粵)2014-00114。所有大鼠正常飼養(yǎng)，自由飲水食物，飼養(yǎng)溫度24 ℃～26 ℃,濕度40%～60%。

1.2 藥物與試劑 山柰酚(Kaempferol，Kae)；紅四氮唑(TTC，天津瑞金特化學(xué)品有限公司)；水合氯醛(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；MDA/SOD/ROS ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)；NF-κB p65、Bcl-2,Bax兔單抗和二抗羊抗兔均購(gòu)自Cell signaling technology；熒光定量PCR試劑盒(美國(guó)Promega生物技術(shù)有限公司)；TNF-α、IL-1β和IL-6引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。熒光定量PCR試劑盒(美國(guó)Promega生物技術(shù)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及大鼠腦缺血再灌注損傷模型的建立 試驗(yàn)動(dòng)物分組：采用隨機(jī)數(shù)字表法將50只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和山柰酚給藥組(10 mg/kg,20 mg/kg,40 mg/kg)，每組各10只大鼠。山柰酚組大鼠連續(xù)灌胃給藥7 d，假手術(shù)組與模型組給予同等體積的生理鹽水(給藥體積為0.1 ml/100 g)，給藥結(jié)束后進(jìn)行腦缺血再灌注造模。

腦缺血再灌注損傷模型的建立：10%水合氯醛腹腔注射(0.35 ml/100 g)麻醉大鼠，仰臥位固定，頸前正中切口，鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈，在頸外動(dòng)脈近分叉處剪一V形切口，緩慢插入尼龍魚線，用鑷子輕輕將栓線送至大腦中動(dòng)脈起始處，結(jié)扎并固定線栓，缺血2 h后拔出線栓。大鼠傷口消毒后縫合切口，術(shù)后24 h進(jìn)行神經(jīng)功能缺失評(píng)估。假手術(shù)組僅進(jìn)行頸動(dòng)脈的分離后縫合切口，不作其他處理。

1.3.2 大鼠神經(jīng)功能缺失評(píng)分 各組大鼠均進(jìn)行神經(jīng)功能缺失評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考Zea-Longa方法[6]：0分，無神經(jīng)功能缺損的癥狀；1分，不能伸展對(duì)側(cè)前爪；2分：行走時(shí)向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走時(shí)向被阻塞大腦的對(duì)側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。1～3分為納入標(biāo)準(zhǔn);0分及4分為排除標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.3 大鼠腦梗死面積比例測(cè)定 各組大鼠完成神經(jīng)功能缺失評(píng)分后，斷頭取腦，沿冠狀面切成2 mm厚的切片，放入2%TTC染液中，避光37 ℃溫孵30 min進(jìn)行染色，經(jīng)10%甲醛溶液固定后，數(shù)碼成像，并用圖像分析系統(tǒng)(V4.0) 測(cè)量梗死區(qū)和全腦面積，計(jì)算腦梗死面積比例(梗死區(qū)面積占全腦面積百分比)。

1.3.4 大鼠海馬組織氧化應(yīng)激程度測(cè)定 取梗死半球側(cè)海馬組織，以生理鹽水制備10%組織勻漿液。根據(jù)試劑盒說明書操作，測(cè)定MDA、SOD、ROS含量。

1.3.5 Real time PCR法檢測(cè)海馬組織中炎癥因子的表達(dá)情況 取海馬組織50 mg，Trizol法提取總RNA，超微量分光光度計(jì)檢測(cè)濃度計(jì)A260/280比值，按逆轉(zhuǎn)錄盒操作說明，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄制備成cDNA。用SYBR綠色核酸燃料進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，GAPDH為內(nèi)參基因。將各樣本PCR反應(yīng)的所得CT值進(jìn)行相對(duì)定量。各樣本均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，基因表達(dá)的相對(duì)變化的倍數(shù)采用2-ΔΔCT計(jì)算。

1.3.6 免疫印跡法檢測(cè)海馬組織蛋白表達(dá)情況 將海馬組織切成小塊，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白，BCA法測(cè)定樣本蛋白含量。 SDS-PAGE分離蛋白后濕法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉1 h后，分別加入一抗NF-κB p65/Bax/Bcl-2/GAPDH，4 ℃搖床孵育過夜，次日用TBST洗膜3次(5分/次);加入二抗室溫避光搖床孵育1 h后，TBST洗膜3次(5分/次)，進(jìn)行膠片曝光，顯影定影。用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值反映蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 山柰酚對(duì)缺血性腦損傷大鼠神經(jīng)功能的影響 經(jīng)腦缺血2 h再灌注24 h后，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能明顯受損，神經(jīng)功能缺失評(píng)分顯著升高(P<0.01)，提示腦缺血再灌注模型建立成功。與模型組比較，山柰酚組大鼠神經(jīng)功能缺失程度明顯減輕，其中,中、高劑量的改善作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)，提示山柰酚可改善腦缺血再灌注引起的神經(jīng)功能損傷(見表1)。

2.2 山柰酚對(duì)缺血性腦損傷大鼠腦梗死面積的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦梗死面積比例顯著增加(P<0.01)。與模型組比較，山柰酚中、高劑量組大鼠腦梗死面積比例明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)，提示山柰酚可抑制腦缺血再灌注引起的大鼠腦梗死(見表2)。

2.3 山柰酚對(duì)缺血性腦損傷大鼠海馬內(nèi)氧化應(yīng)激因子的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬內(nèi)MDA和ROS含量明顯增加(P<0.01),SOD酶的含量明顯減少(P<0.01)，提示缺血性腦損傷大鼠海馬內(nèi)氧化應(yīng)激水平明顯升高。與模型組相比，山柰酚各劑量組均能顯著性逆轉(zhuǎn)這些指標(biāo)的含量變化(P<0.05，P<0.01)，提示山柰酚能降低缺血性腦損傷大鼠海馬內(nèi)氧化應(yīng)激水平，具有較強(qiáng)的中樞抗氧化作用(見表3)。

2.4 山柰酚對(duì)缺血性腦損傷大鼠腦組織炎癥反應(yīng)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬內(nèi)NF-κB p65蛋白及TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的表達(dá)則顯著上升(P<0.01)。說明腦缺血引起的組織損傷激活了大鼠海馬內(nèi)NF-κB通路，介導(dǎo)了炎癥反應(yīng)的發(fā)生。不同劑量的山柰酚均呈現(xiàn)一定程度的逆轉(zhuǎn)作用，中、高劑量顯著減少NF-κB p65的蛋白表達(dá)和TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表達(dá) (P<0.05,P<0.01)。說明山柰酚對(duì)缺血性腦損傷大鼠有抗神經(jīng)炎癥的作用(見圖1)。

2.5 山柰酚對(duì)缺血性腦損傷大鼠腦組織凋亡相關(guān)蛋白的影響 與假手術(shù)相比，模型組大鼠海馬內(nèi)Bax蛋白表達(dá)明顯增加，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.01)。該結(jié)果提示缺血性腦損傷大鼠海馬內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。預(yù)先給予山柰酚處理后，與模型組大鼠比較，大鼠海馬內(nèi)兩者的蛋白表達(dá)水平變化均得到逆轉(zhuǎn)，且作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，即說明山柰酚可抑制缺血性腦損傷大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡(見圖2)。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺失評(píng)分

與假手術(shù)組相比#P<0.01；與模型組相比*P<0.05,**P<0.01

表2 各組大鼠TTC染色后腦梗死面積

與假手術(shù)組相比#P<0.01;與模型組相比*P<0.05,**P<0.01

與假手術(shù)組相比#P<0.01;與模型組相比*P<0.05,**P<0.01

3 討 論

缺血性腦卒中，又稱缺血性腦損傷，是腦卒中的主要類型，該疾病通常由腦內(nèi)動(dòng)脈栓塞造成局部供血障礙引起。缺血性腦損傷尚無有效治療手段，組織型纖溶酶原激活物(tPA)是目前唯一被美國(guó)食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)治療腦卒中的藥物，用于溶栓治療重新打開被阻塞的血管[7]。而現(xiàn)有的治療方法和措施，并未明顯改變?nèi)毖阅X卒中致死率、致殘率和復(fù)發(fā)率極高的現(xiàn)狀。因此，尋找防治缺血性腦卒中發(fā)生的治療藥物十分迫切。本研究首次發(fā)現(xiàn)，山柰酚預(yù)防給藥能有效改善缺血性腦損傷大鼠神經(jīng)功能缺損，通過抗氧化、抗炎及抗凋亡作用機(jī)制減輕腦卒中后組織梗死面積，是預(yù)防和治療腦卒中的潛在藥物之一。

活性氧(ROS)主要包含超氧陰離子(O2-)、羥自由基(OH-)和過氧化氫(H2O2)等，當(dāng)腦組織缺血缺氧時(shí)，過量的氧自由基可通過多個(gè)環(huán)節(jié)造成腦組織損傷；丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的降解產(chǎn)物，可間接反映腦組織受自由基損傷程度；超氧化物歧化酶(SOD)作為自由基清除劑，其活性可反映組織內(nèi)源性的抗氧化能力[8]。本研究結(jié)果表明山柰酚降低大鼠海馬組織ROS和MDA水平，提高SOD活性，從而減輕腦缺血再灌注引起的氧化應(yīng)激損傷，即山柰酚發(fā)揮了中樞抗氧化作用。腦缺血再灌注后可激活了NF-κB信號(hào)聯(lián)通路，導(dǎo)致腦內(nèi)大量炎癥因子的釋放，進(jìn)一步加劇了腦組織損傷[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，山柰酚可抑制海馬組織NF-κB p65的蛋白表達(dá)，進(jìn)而減少了TNF-α、IL-1β及IL-6的mRNA表達(dá)，即山柰酚的中樞抗神經(jīng)炎癥作用。

大量炎癥因子的釋放與聚集會(huì)對(duì)神經(jīng)元造成損傷或凋亡，進(jìn)而誘發(fā)腦組織損傷[10]。Bax蛋白和Bcl-2蛋白是細(xì)胞凋亡途徑的重要調(diào)控蛋白，Bax蛋白能在線粒體膜上形成孔道，使細(xì)胞色素C等小分子物質(zhì)進(jìn)入胞質(zhì)從而促進(jìn)凋亡的發(fā)生，Bcl-2蛋白能通過封閉孔道，調(diào)控線粒體膜電位等方式抑制凋亡[11]。本實(shí)驗(yàn)選用免疫印跡技術(shù)對(duì)Bax蛋白和Bcl-2蛋白的表達(dá)進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，山柰酚能顯著降低缺血性腦損傷大鼠梗死側(cè)海馬組織促凋亡蛋白Bax表達(dá)，升高抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，提示山柰酚改善腦缺血損傷與其抗凋亡作用有關(guān)。

綜上所述，本研究通過抗氧化、抗炎及抗凋亡三方面作用機(jī)制證實(shí)山柰酚對(duì)缺血性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用，該結(jié)果為探討山柰酚在腦卒中的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。