腸道菌群失調(diào)加重小鼠局灶性腦缺血再灌注后炎性反應(yīng)

李元培， 韓 晉， 紀(jì)明慧， 董瑞賓， 石艷超

人類腸道至少含有1000種菌群，共計超過100萬億個細(xì)菌[1]。飲食習(xí)慣、生活方式、衛(wèi)生習(xí)慣、遺傳因素、抗菌藥的使用等都會影響腸道菌群的種類和豐富度[2，3]，同時其在體內(nèi)數(shù)量和比例呈現(xiàn)動態(tài)改變。炎性反應(yīng)是腦缺血再灌注損傷 (cerebral ischemia reperfusion injury,CIR)中復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)之一，涉及多種炎性介質(zhì)、炎性細(xì)胞及炎癥反應(yīng)通路，阻斷CIR中炎性反應(yīng)可顯著減輕腦損傷。有研究表明[4]，腸道菌群失調(diào)與心腦血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)，其通過炎性反應(yīng)促進(jìn)動脈粥樣硬化的形成。

本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)造腦缺血再灌注動物模型，觀察腸道菌群失調(diào)對小鼠腦缺血的影響、神經(jīng)功能缺損和腦水腫的程度，血腦屏障功能-即ZO-1表達(dá)的情況，以及IL-6、TNF-α和NF-κB炎性標(biāo)志物的變化，旨在探討腸道菌群失調(diào)對CIR中炎性反應(yīng)的影響，以期為臨床治療腦梗死提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及處理 SPF級健康6 w齡性C57BL/6J小鼠，雄性，體重(20±2)g飼養(yǎng)于SPF環(huán)境設(shè)施。飲用水經(jīng)高壓滅菌消毒，飼料經(jīng)鈷60照射處理。隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組(對照組)和菌群失調(diào)組。造模前4 d始，假手術(shù)組和對照組胃內(nèi)注入同體積的生理鹽水0.2 ml，菌群失調(diào)組胃內(nèi)注入100 mg/ml的頭孢曲松溶液0.2 ml，每天兩次，時間間隔8 h，連續(xù)灌胃4 d。

1.2 小鼠CIR模型制作 參照文獻(xiàn)[2]報道的Zea Longa法制備改良線栓法大腦中動脈栓塞模型。術(shù)前禁食12 h，不禁飲。腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg麻醉，仰臥位固定于37 ℃恒溫電熱板上。取頸部正中切口，游離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸總動脈近心端，以無創(chuàng)血管夾夾閉頸總動脈遠(yuǎn)心端及頸外動脈，于頸總動脈分叉下方剪開一切口，放置預(yù)先頭端鈍化處理的尼龍線(北京西濃科技有限公司)，緩慢推進(jìn)8～10 mm，感覺有阻力時停止，固定于頸總動脈。栓塞1 h后，拔出線栓恢復(fù)血流。單籠飼養(yǎng)，自由飲食。再灌注后2 h采用神經(jīng)功能評分驗(yàn)證造模是否成功，即造模小鼠出現(xiàn)右側(cè)Horner征和左側(cè)以上肢為重的偏癱，作為動物模型成功的判定標(biāo)準(zhǔn)，剔除不符合標(biāo)準(zhǔn)或死亡的動物，并隨機(jī)補(bǔ)充。假手術(shù)組除不插入線栓外其余相同。

1.3 小鼠神經(jīng)功能評定 于再灌注后72 h時，進(jìn)行神經(jīng)功能評分，參照Zea Longa評分標(biāo)準(zhǔn)：0分,無神經(jīng)損傷癥狀；1分,輕微神經(jīng)功能缺損，不能完全伸展對側(cè)前爪；2分,重度局灶性神經(jīng)功能缺損，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分,重度局灶性神經(jīng)功能缺損，向?qū)?cè)傾倒；4分,不能自發(fā)行走，意識喪失。

1.4 腸道菌群培養(yǎng)及計數(shù) 腦缺血再灌注后72 h，無菌條件下取升結(jié)腸內(nèi)容物，稱重后立即將其稀釋成10～7濃度，然后分別接種于腸球菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌的相應(yīng)培養(yǎng)基中，腸球菌培養(yǎng)基置于35 ℃孵育箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，乳酸桿菌和雙歧桿菌培養(yǎng)基置于35 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，并對相應(yīng)菌群進(jìn)行檢測。結(jié)果以每克升結(jié)腸內(nèi)容物濕重中菌落形成單位的對數(shù)值表示(lg CFU/g)。

1.5 腦梗死體積的測定 取再灌注后72 h的小鼠，斷頭取腦置于-20 ℃冰箱內(nèi)30 min，自視交叉水平行5個腦冠狀切片，片厚約2 mm，將其置于2%的TTC溶液中，37 ℃避光孵育30 min，染色后置于10%甲醛溶液中于4 ℃避光固定24 h，肉眼觀察并拍照。應(yīng)用Image J 軟件計算腦梗死體積，公式為：腦梗死體積(%)=[總的梗死體積-(右側(cè)半球體積-左側(cè)半球體積)]/左側(cè)半球體積×100%。

1.6 腦組織含水量的測定 再灌注后72 h，經(jīng)神經(jīng)功能評分后，立即將小鼠斷頭處死。取缺血側(cè)腦組織迅速稱其濕重，然后置于100 ℃高溫烤箱內(nèi)，烘干48 h后稱其干重。按照Elliott公式，計算出腦含水量，公式為：腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.7 Western blot法檢測缺血側(cè)腦組織NF-κB p65和ZO-1的表達(dá) 取再灌注后72 h的小鼠，腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg麻醉后，冰PBS心臟灌流，斷頭取腦。取缺血側(cè)大腦半球，提取腦組織蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒(賽默飛世爾科技)檢測蛋白濃度。每孔加入等量蛋白，10%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，然后轉(zhuǎn)移至甲醇浸泡過的PVDF膜上，1.5%胎牛血清室溫封閉1 h后，分別加入NF-κB p65一抗(1∶1000,CST)、ZO-1一抗(1∶500,CST)和β-actin一抗(1∶2000,Santa Cruz)，室溫孵育12 h后，置入4 ℃冰箱過夜。加入二抗(1∶5000,Transgen Biotech)，室溫孵育2 h。每個條帶加入顯影液發(fā)光，采用Image J軟件測定灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值反應(yīng)目的蛋白的表達(dá)水平。

1.8 實(shí)時定量PCR 取每只小鼠缺血側(cè)大腦半球 獲得總 RNA后取10 μl按照反轉(zhuǎn)錄酶Ⅱ試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄操作。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，進(jìn)入循環(huán)，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共循環(huán)40次，隨后95 ℃延伸15 s，60 ℃延伸1 min，95 ℃再延伸15 s，最后降至4 ℃。分別得到IL-6、TNF-α和內(nèi)參β-actin的Ct值后，采用相對定量的方法計算，△Ct=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值。以2-△Ct為指標(biāo)，分別計算出IL-6、TNF-α和內(nèi)參β-actin mRNA的相對表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，求得平均值作為分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 腸道菌群計數(shù) 缺血再灌注后72 h，取小鼠升結(jié)腸內(nèi)糞便進(jìn)行培養(yǎng)、計數(shù)。假手術(shù)組和對照組腸道內(nèi)菌群無差異(P>0.5)。菌群失調(diào)組小鼠腸球菌增多，乳酸桿菌及雙歧桿菌減少，與假手術(shù)組及對照組相比存在差異(P<0.05)(見表1)。

2.2 神經(jīng)功能評分 小鼠取材前進(jìn)行神經(jīng)功能評分。假手術(shù)組因未阻塞大腦中動脈，未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀，評分均為0分。與假手術(shù)組比較，對照組和菌群失調(diào)組的神經(jīng)功能評分較高(P<0.05)；與對照組比較，菌群失調(diào)組神經(jīng)功能評分較高(P<0.05)(見表2)。

2.3 腦梗死體積和含水量的測定 假手術(shù)組小鼠腦組織未見腦梗死區(qū)域，對照組可見明顯腦梗死灶(P<0.01)，與對照組相比，菌群失調(diào)組腦梗死灶體積明顯增大(P<0.05)(見圖1)；3組間腦含水量有明顯差異(P<0.05)，菌群失調(diào)組腦含水量較對照組高(P<0.05)(見表3)。

2.4 NF-κB p65和ZO-1蛋白的表達(dá)量 與假手術(shù)組比較，對照組和菌群失調(diào)組的NF-κB p65表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05);與對照組比較，菌群失調(diào)組的NF-κB p65的表達(dá)增加(P<0.05)。與假手術(shù)組比較，對照組和菌群失調(diào)組的ZO-1表達(dá)明顯減少(P<0.05);與對照組比較，菌群失調(diào)組ZO-1的表達(dá)減低(P<0.05)(見圖2、表4)。

2.5 IL-6和TNF-α表達(dá)量 與假手術(shù)組比較，對照組和菌群失調(diào)組的IL-6和TNF-α mRNA相對表達(dá)量明顯升高(P<0.05);與對照組比較，菌群失調(diào)組的IL-6和TNF-α mRNA相對表達(dá)量明顯升高P<0.05)(見表5)。

表1 灌胃5 d小鼠腸道菌群的分布

與假手術(shù)組相比較*P>0.05；與菌群失調(diào)組相比較#P<0.05

表2 腦再灌注后72 h各組小鼠神經(jīng)功能評分

與假手術(shù)相比較*P<0.05；與對照組相比較#P<0.05

表3 腦再灌注后72 h各組小鼠腦梗死體積及腦含水量比較

與假手術(shù)組相比較*P<0.05；與對照組相比較#P<0.05

表4 腦再灌注后72 h各組小鼠腦組織NF-κB p65和ZO-1的表達(dá)量

與假手術(shù)組相比較*P<0.05；與對照組相比較#P<0.05

表5 腦再灌注后72 h各組小鼠腦組織IL-6 mRNA和TNF-α mRNA 相對表達(dá)量

與假手術(shù)組相比較*P<0.05；與對照組相比較#P<0.05

圖1 腦再灌注后72 h各組小鼠腦梗死體積

圖2 再灌注后72 h，各組小鼠梗死側(cè)腦組織NF-κB p65 和ZO- 1印跡條帶

3 討 論

腸道菌群參與生命早期腸道免疫的形成，機(jī)體的慢性感染可促進(jìn)動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展。腸道菌群可影響宿主的新陳代謝、免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)[5]。通過分析微生物的功能組學(xué)發(fā)現(xiàn)，癥狀性動脈粥樣硬化患者腸道菌群富含編碼肽聚糖合成的基因，肽聚糖是細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，可能通過激活機(jī)體免疫系統(tǒng)和中性粒細(xì)胞引起動脈粥樣硬化[4]。動脈粥樣硬化是腦卒中最常見的病理過程，血管炎癥是動脈粥樣硬化的重要環(huán)節(jié)。病理狀態(tài)下，微生物激活機(jī)體固有免疫系統(tǒng)，促進(jìn)炎性反應(yīng)，加重血管炎癥[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，通過腸道菌群移植可增加血栓風(fēng)險[7]。

也有研究表明證實(shí)，腸道菌群的代謝產(chǎn)物可通過激活免疫系統(tǒng)，加重血管壁炎癥，促進(jìn)動脈硬化。少量腸道細(xì)菌可進(jìn)入血液循環(huán)，引起全身慢性低度炎癥，這種慢性炎癥在動脈粥樣硬化中普遍存在[8]。腸道菌群失調(diào)參與代謝性和炎癥性疾病的發(fā)生和進(jìn)展，因此保持腸道菌群穩(wěn)態(tài)尤為重要。然而，其在腦梗死中的作用尚未見報道。

CIR損傷的機(jī)制主要包括興奮性氨基酸毒性、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、一氧化碳失調(diào)控、炎性反應(yīng)等。炎性反應(yīng)在CIR損傷中起著關(guān)鍵作用，加重了腦損害[9]，其病理基礎(chǔ)以IL-6和TNF-α等為代表的多種炎性介質(zhì)失控、釋放而形成“瀑布效應(yīng)”，引起繼發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死、凋亡等[10]。IL-6是觸發(fā)炎性反應(yīng)的重要介質(zhì)之一，腦缺血后其表達(dá)增多，對神經(jīng)元有毒性作用，目前認(rèn)為其是急性缺血期腦損傷程度的一個標(biāo)志[11]。TNF-α是中樞神經(jīng)系統(tǒng)參與炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答的重要介質(zhì)，其可激活小膠質(zhì)細(xì)胞、破壞BBB、促進(jìn)炎性細(xì)胞的遷移，最終對神經(jīng)元造成損傷[12]。

基于以上研究，我們推測，腸道菌群失調(diào)通過影響免疫炎癥反應(yīng)加重了腦梗死的病情。

CIR模型是研究腦梗死較好的動物模型，腦梗死的體積直接反映了腦損傷的嚴(yán)重程度，神經(jīng)功能評分間接反映了病情的嚴(yán)重程度。本實(shí)驗(yàn)，成功制造了腸道菌群失調(diào)動物模型，發(fā)現(xiàn)菌群失調(diào)組的神經(jīng)功能評分及腦含水量高于對照組，提示腸道菌群失調(diào)在一定程度上加重了CIR小鼠的神經(jīng)功能缺損及腦水腫程度。我們的實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)CIR后，促炎因子IL-6和TNF-α于梗死側(cè)半球異常過度表達(dá)，推測腸道菌群失調(diào)加重了其異常表達(dá)。在多種細(xì)胞中，缺血、缺氧誘發(fā)了NF-κB的活化[13]，活化的NF-κB誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，加重了病情。菌群失調(diào)組中，NF-κB p65的表達(dá)明顯增加，神經(jīng)功能缺損評分升高，我們推測腸道菌群失調(diào)在一定程度上促進(jìn)了NF-κB的活化。

ZO-1與BBB通透性的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，其表達(dá)變化可作為衡量BBB損傷程度的標(biāo)志，腦損傷后其表達(dá)明顯下降，提示血BBB通透性增加[14]。為了解腸道菌群在CIR后對BBB的影響，我們觀察了代表BBB功能的ZO-1的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與對照組相比較，菌群失調(diào)組中ZO-1的表達(dá)水平降低及腦水腫程度加重，由此，我們推測腸道菌群失調(diào)破壞了BBB的完整性。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群失調(diào)損害了BBB的完整性，在一定程度上加重了腦水腫程度和增加了腦梗死體積，促進(jìn)了致炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，增加了BBB的通透性，其機(jī)制可能是通過促進(jìn)NF-κB的激活，對腦組織損傷起到了一定的促進(jìn)作用。另外，患者腦梗死后，部分由于進(jìn)食障礙、便秘、質(zhì)子泵抑制劑的應(yīng)用、抗生素的應(yīng)用等因素造成腸道菌群失調(diào)，可能會加重腦梗死病情。提示我們在臨床工作中，重視腸道菌群失調(diào)在腦梗死患者發(fā)病中的作用，為臨床腦梗死治療提供新的方向，糾正腸道菌群失調(diào)是治療CIR后炎性反應(yīng)的新靶點(diǎn)。