ApoE調(diào)節(jié)谷氨酸及其受體表達對視神經(jīng)脊髓炎體外模型的作用研究

艾飛飛， 孫淑君， 陳繪穎， 游曼航， 覃小清， 唐玉蘭， 韋云飛

谷氨酸(Glu)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)重要神經(jīng)遞質(zhì),病理條件下Glu因過度釋放或攝取轉(zhuǎn)移障礙影響膜電位及細胞內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致ATP耗竭細胞凋亡[1]。N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)為一類谷氨酸受體，包括NMDAR1、NMDAR2B 2個必需的亞單位，其中NMDAR2B在谷氨酸誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)損害中占重要位置[2]。Glu及NMDAR1、NMDAR2B在同是CNS炎性脫髓鞘的視神經(jīng)脊髓炎(NMO)中表達如何？是否參與NMO致??？尚不清楚。研究表明ApoE能夠減少缺氧誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞谷氨酸釋放[3]，ApoE受體與NMDAR亞單位存在交聯(lián),ApoE擬肽能夠抑制NMDAR功能及其誘導(dǎo)的興奮毒性作用[4～6]。在NMO中ApoE是否影響谷氨酸濃度及NMDAR受體表達？尚不清楚。本研究通過檢測WT及ApoE-/-體外NMO模型NMDAR1及NMDAR2B表達量及培養(yǎng)液谷氨酸濃度,從而探討谷氨酸及其受體NMDAR1、NMDAR2B及ApoE在NMO發(fā)病中的作用。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 7～14 d清潔級ApoE-/-及野生型(WT)型C57BL/6J乳鼠，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。動物許可證號為：SCK(京)2009-0004。

1.1.2 主要實驗試劑及材料 混合正常人補體(HC)血清購自Innovative-research公司；兔抗小鼠NMDAR2B多克隆抗體、兔抗小鼠NMDAR1單克隆抗體、羊抗小鼠GFAP多克隆抗體、兔抗小鼠AQP4多克隆抗體購自Abcam公司；FITC標記山羊抗人IgG、CY3 標記羊抗兔IgG購自博奧森公司；谷氨酸測定試劑盒購自南京建成公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)購自碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 NMO脊髓切片模型制備 取7～14 d的ApoE-/-乳鼠和WT乳鼠處死取脊髓，連續(xù)橫切成300 μm脊髓切片置于30 mm 4 μm trans-well膜上培養(yǎng)，每3 d更換培養(yǎng)液一次。第7～14天換成含300 μg/ml NMO-IgG+10%正常補體血清的培養(yǎng)液，另設(shè)不加NMO-IgG+10%正常補體血清對照組；孵育3 d制成NMO脊髓切片模型及空白對照脊髓切片模型。

1.2.2 NMO視神經(jīng)切片模型與腦組織切片制備 取6～8 w WT及ApoE-/-小鼠處死分離視神經(jīng)置于30 mm 4 μm trans-well膜上培養(yǎng)，1 d后培養(yǎng)液中加入NMO-IgG+10%正常補體血清干預(yù)視神經(jīng)24 h。另設(shè)置不加抗體及補體的WT視神經(jīng)對照組。取視神經(jīng)的同時取腦組織用4 ℃ 4%多聚甲醛固定備用。

1.2.3 免疫組織熒光法研究各組GFAP、AQP4表達 視神經(jīng)、腦和脊髓切片4%多聚甲醇5 ℃固定制成石蠟切片，經(jīng)烤片、脫蠟、脫二甲苯、抗原修復(fù)、封閉后，加入特異性一抗4 ℃孵育過夜；加入二抗，37 ℃孵育1 h。滴加抗熒光衰減封片劑封片。

1.2.4 Glu濃度測定 按照Glu測定試劑盒說明測定并計算各組培養(yǎng)液Glu濃度。取96孔板，按說明書加樣、孵育，測定吸光值，按照公式計算谷氨酸濃度：谷氨酸濃度(μmol/L)=[(測定A2值-測定A1值)-(空白A2值-空白A1值)]/[(標準A2值-標準A1值)-(空白A2值-空白A1值)]×標準品濃度×測試樣本前稀釋倍數(shù)。

1.2.5 蛋白免疫印記研究各組NMDAR1、NMDAR2B蛋白表達 取脊髓切片、視神經(jīng)組織提取蛋白后使用BCA試劑盒定量。將各組濃度調(diào)整至等濃度，混勻后將蛋白樣品與5×Loading buffer按1∶4體積比混合煮沸5 min，使用5%SDS-PAGE電泳分離，分離的蛋白在MiniTrans-Blot Cell (BioRad)中電轉(zhuǎn)移到PVDF膜。4 ℃ 封閉過夜，加入一抗，室溫孵育1 h;加入二抗，室溫孵育1 h，PBST洗膜3次。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織熒光染色法研究GFAP、AQP4缺失 用Image-Pro Plus 6.0軟件檢測各組缺失面積：對照組(C-WT 組)脊髓及視神經(jīng)無QP4及GFAP染色缺失。 ApoE-/-NMO-IgG+HC組和WT NMO-IgG+HC組均見不同程度AQP4及GFAP的染色缺失，兩組染色缺失比例高于對照組(P<0.05)。ApoE-/-NMO-IgG+HC組較WT NMO-IgG+HC 組缺失比例更高(P<0.05),結(jié)果(見圖1)。

2.2 各組NMDAR1、NMDAR2B蛋白表達 通過Quantity One分析Western blot NMDAR1、NMDAR2B表達灰度值，A、C圖示脊髓NMDAR1、NMDAR2B表達：WT NMO-IgG+HC組、ApoE-/-NMO-IgG+HC組均顯著高于對照組(P<0.05)；NMDAR2B在ApoE-/-NMO-IgG+HC組顯著高于WT NMO-IgG+HC組(P<0.05)。 B圖示視神經(jīng)NMDAR1、NMDAR2B表達在對照組、WT NMO-IgG+HC組、ApoE-/-NMO-IgG+HC組呈依次增高趨勢,結(jié)果(見圖2)。

2.3 各組培養(yǎng)液谷氨酸濃度 測量脊髓、視神經(jīng)培養(yǎng)液中谷氨酸濃度。各組脊髓及視神經(jīng)培養(yǎng)液谷氨酸濃度均無顯著性差異(P>0.05)(見表1)。

表1 各組培養(yǎng)液中谷氨酸濃度(μmol/L)

脊髓切片培養(yǎng)液谷氨酸濃度各組間無顯著性差異*P>0.05；視神經(jīng)培養(yǎng)液谷氨酸濃度各組間無顯著性差異#P>0.05

A.脊髓GFAP熒光染色(4×)；B.脊髓AQP4熒光染色(4×)；C.視神經(jīng)GFAP熒光染色(200×)；D.視神經(jīng)AQP4熒光染色(200×)

圖1 各組GFAP、AQP4免疫組織化學(xué)熒光染色

A.各組脊髓組織NMDAR1、NMDAR2B蛋白表達量；B.各組視神經(jīng)組織NMDAR1、NMDAR2B蛋白表達量；C.各組脊髓組織NMDAR1、NMDAR2B蛋白表達水平柱狀圖分析

圖2 各組NMDAR1、NMDAR2B蛋白表達

3 討 論

谷氨酸(Glu)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，因攝取、轉(zhuǎn)運障礙導(dǎo)致蓄積于中樞的Glu可通過激活離子型谷氨酸受體(NMDAR)誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細胞興奮性毒性損傷，致使中樞神經(jīng)及視神經(jīng)髓鞘脫失[7,8]。研究表明谷氨酸及其受體可能在自身免疫性炎癥疾病中發(fā)揮重要作用,多發(fā)性硬化患者急性髓鞘損傷部位及腦脊液中谷氨酸濃度增高[9,10]，高選擇性NMDAR抑制劑RO25-6981明顯改善多發(fā)性硬化動物模型的神經(jīng)缺損并緩解脊髓組織炎性反應(yīng)、髓鞘及神經(jīng)軸突缺失[11]。另有研究表明NMDAR受體拮抗劑能夠減少NMO-IgG誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)細胞病理凋亡及脫髓鞘化過程[12]。由此表明谷氨酸及受體可能在NMO發(fā)病中發(fā)揮作用。

我們對各組脊髓組織和視神經(jīng)的培養(yǎng)液Glu濃度及其受體水平進行對比研究，結(jié)果NMO-IgG+HC干預(yù)組脊髓及視神經(jīng)培養(yǎng)液與對照組的Glu濃度無差異，但谷氨酸受體NMDAR1及NMDAR2B亞單位表達顯著高于對照組，同時脊髓和視神經(jīng)組織的GFAP及AQP4缺失顯著于對照組。我們的結(jié)果表明在HC和NMO-IgG共同誘導(dǎo)作用下脊髓和神經(jīng)組織的NMDAR1、NMDAR2B表達上調(diào)的同時病理損傷加劇。哺乳動物細胞功能性NMDARs至少包含一個NMDAR1亞單位和一個NMDAR2B亞單位(主要為NMDAR2A、NMDAR2B)，包含NMDAR2B的NMDARs主要定位于突觸外，該類受體在介導(dǎo)谷氨酸興奮毒性作用中發(fā)揮重要作用[13]。這也許是本項目各組谷氨酸濃度無差異，但表達增多的NMDAR1及NMDAR2B依然能夠增強谷氨酸的興奮毒性作用，最終致使干預(yù)組神經(jīng)組織GFAP及AQP4缺失顯著的原因。Honda K等報道腦脊液抗NMDAR2B抗體表達陽性的NMO患者雖然脊髓損傷范圍廣泛，但臨床癥狀表現(xiàn)輕微[14]；NMDARs受體拮抗劑金剛烷胺明顯減少視神經(jīng)炎患者的視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層變薄[15]；NMDAR受體拮抗劑能夠減輕NMO陽性患者血清誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)細胞缺失[13]。細胞外Glu濃度取決于其攝取及轉(zhuǎn)運，其中在CNS中90%谷氨酸攝取由興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白2(EAAT2)介導(dǎo)，因此我們推測NMO-IgG不影響EAAT2表達及Glu攝取轉(zhuǎn)運，因而本項目各組培養(yǎng)液的Glu濃度無差異。Ratelade報道高濃度AQP4-IgG并不能誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞EAAT2內(nèi)化，也并不影響培養(yǎng)液中谷氨酸濃度，其不通過影響谷氨酸攝取及轉(zhuǎn)運而參與NMO致病[16]，也支持我們的研究結(jié)果。因此我們推測NMO-IgG在補體依賴作用下能誘導(dǎo)神經(jīng)組織NMDAR1、NMDAR2B表達增強，促進誘導(dǎo)谷氨酸興奮性毒性作用,從而加劇星形膠質(zhì)細胞GFAP及AQP4的缺失,加劇病理損害，即NMDAR誘導(dǎo)的興奮毒性作用可能在NMO致病中發(fā)揮作用。

ApoE是一種主要的載脂蛋白，在中樞主要由星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生，在免疫系統(tǒng)中起著重要的作用，包括抑制淋巴細胞增殖、調(diào)節(jié)巨噬細胞的功能、減少氧化應(yīng)激等。研究表明APOE-受體2與N-甲基-D-天冬氨酸受體NMDAR1和NMDAR2亞基的有相互作用，ApoE可能通過影響谷氨酸及其受體的表達對NMO產(chǎn)生作用。為了探索兩者之間的關(guān)系，我們用NMO-IgG+HC共同孵育WT組與ApoE-/-組的脊髓及視神經(jīng)組織。結(jié)果ApoE-/-組與WT組培養(yǎng)液Glu濃度無統(tǒng)計學(xué)差異,表明ApoE不影響Glu代謝，但我們發(fā)現(xiàn)ApoE缺失能夠顯著增加NMDAR2B亞單位的表達。我們進一步的病理研究結(jié)果提示NMDAR2B表達顯著增高的ApoE-/-組脊髓及視神經(jīng)組織相較于WT組AQP4、GFAP缺失加劇，這表明ApoE缺失顯著增加NMDAR2B表達的同時組織病理損傷加重。再次證實我們上面的討論中提到的NMO時表達增多的NMDAR1及NMDAR2B引發(fā)NMDARs誘導(dǎo)的興奮毒性作用，使低濃度的谷氨酸狀態(tài)下亦能明顯加重NMO的病理損傷的推斷。

ApoE缺失導(dǎo)致神經(jīng)組織病理損傷加重，可能與APOE對NMDAR的相互作用有關(guān)。ApoE受體(如APOER2、VLDLR)通過細胞外基質(zhì)reelin蛋白與NMDAR產(chǎn)生關(guān)聯(lián)并結(jié)合；而ApoE通過與APOER2、VLDLR結(jié)合從而抑制reelin蛋白介導(dǎo)的NMDAR活化，間接對抗谷氨酸的神經(jīng)毒性作用。所以當ApoE缺失時，NMDAR活化增強，特別是NMDAR2B表達增多，谷氨酸的神經(jīng)毒性作用加強，從而導(dǎo)致神經(jīng)組織病理損傷加重。Zhenyu Sheng等報道，載脂蛋白E衍生肽對N-甲基-D-天冬氨酸受體的抑制依賴于低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白，發(fā)現(xiàn)ApoE的活性取決于低密度脂蛋白受體 (LRP)[17]。 NMDAR結(jié)合的谷氨酸能特性依賴于其特定的亞基組成，并且NMDAR亞基基因的不同時間和空間表達的改變可導(dǎo)致各種神經(jīng)病理學(xué)。因而ApoE與NMDAR在NMO中的具體相互作用有待進一步研究。