組蛋白去乙?；敢种苿〧K—228誘導(dǎo)人舌癌細(xì)胞的凋亡研究

趙晶

[摘要] 目的 探討組蛋白去乙?；敢种苿〧K-228對(duì)Tca-8113細(xì)胞增殖、凋亡機(jī)制。 方法 低糖DMEM培養(yǎng)Tca-8113；倒置顯微鏡觀察Tca-8113細(xì)胞受FK228的作用；在不同藥物濃度處理24 h、48 h、72 h后利用CCK-8檢測(cè)Tca-8113細(xì)胞增殖情況；Tca-8113凋亡細(xì)胞利用DNA ladde試劑盒檢測(cè)。 結(jié)果 0.1 μg/mL，2 μg/mL，4 μg/mL FK-228對(duì)Tca-8113處理24 h、48 h、72 h后均有抑制作用，且與劑量、作用時(shí)間呈正相關(guān)。經(jīng)FK228藥物處理48 h后的細(xì)胞有DND LDEER出現(xiàn)。 結(jié)論 組蛋白去乙酰化酶抑制劑FK-228可呈降低人口腔鱗癌Tca-8113細(xì)胞活性，抑制其細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

[關(guān)鍵詞] CCK-8；細(xì)胞凋亡；組蛋白去乙?；敢种苿籉K-228

[中圖分類號(hào)] R739.8 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）20-0044-03

Study on histone deacetylase inhibitor FK-228 in the induction of apoptosis of human tongue carcinoma cells

ZHAO Jing

Department of Stomatology， Fushun Mining Bureau General Hospital， Fushun 131000， China

[Objective] Abstract To investigate the mechanism of proliferation and apoptosis of Tca-8113 cells by histone deacetylase inhibitor FK-228. Methods Tca-8113 was cultured by low glucose DMEM； the effect of FK228 on Tca-8113 cells was observed by inverted microscope； the proliferation of Tca-8113 cells was detected by CCK-8 at 24h， 48h and 72h after being treated by different drug concentrations. Tca-8113 apoptotic cells were detected by DNA ladde kit. Results After Tca-8113 was treated for 24 h， 48 h and 72 by 0.1 μg/mL， 2 μg/mL and 4 μg/mL FK-228， all showed an inhibitory effect， which was positively correlated with the dose and the time of effect. There were DND LDEER appeared in cells treated with FK228 for 48 hours. Conclusion The histone deacetylase inhibitor FK-228 reduces the activity of human oral squamous carcinoma Tca-8113 cells， inhibits cell proliferation and induces apoptosis.

[Key words] CCK-8； Apoptosis； Histone deacetylase inhibitor； FK-228

口腔癌的發(fā)病率居全身惡性腫瘤的第六位，目前已是最常見(jiàn)的惡性腫瘤?？谇粣盒阅[瘤治療不理想[1]，口腔鱗癌是頭頸部常見(jiàn)惡性腫瘤，在我國(guó)其發(fā)病率占頭頸部惡性腫瘤的40%，而5年生存率僅40%～50%[2]。組蛋白去乙?；敢种苿╤istone deacetylase inhibitors，HDACis）抑制（包括組蛋白）殘留的賴氨酸蛋白的脫乙?；?，并調(diào)節(jié)各種基因的轉(zhuǎn)錄。近年來(lái)，已被臨床用作抗癌藥物和可能的抗糖尿病藥物，但有證據(jù)表明高劑量的HDACis是有細(xì)胞毒性的[3-4]。針對(duì)組蛋白去乙?；冈诎┌Y細(xì)胞中缺少調(diào)節(jié)這一弱點(diǎn)可作為治療腫瘤細(xì)胞的新靶點(diǎn)[5]。本實(shí)驗(yàn)研究不同濃度的FK-228作用于口腔鱗癌Tca-8113后觀察細(xì)胞增殖、凋亡，討論組蛋白去乙?；敢种苿?duì)腫瘤細(xì)胞的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人舌癌鱗狀細(xì)胞Tca-8113由上海交通大學(xué)贈(zèng)予。FK-228采購(gòu)自美國(guó)MCE公司，DMEM、胎牛血清采購(gòu)自Gibco公司，PBS液由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供，CCK-8試劑盒由日本同仁采購(gòu)，瓊脂糖凝膠由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供，DNA Ladder凋亡試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞組織學(xué)培養(yǎng)及細(xì)胞觀察形態(tài) Tca-8113細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)旺盛時(shí)取3×105/孔接種于96孔板中，37℃ CO2溫箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后更換低糖DMEM培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)整體過(guò)程注意無(wú)菌操作，設(shè)立實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組。24 h、48 h、72 h后在倒置相差顯微鏡下觀察藥物濃度為0.1 μg/mL，2 μg/mL，4 μg/mL后細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.2 細(xì)胞增殖檢測(cè) 通過(guò)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞抑制率：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的Tca-8113細(xì)胞3×105/孔置于96孔板中，24 h后更換培養(yǎng)液：①空白孔（培養(yǎng)液）；②對(duì)照組（不加藥）；③實(shí)驗(yàn)組，加入終濃度為0.1 μg/mL，2 μg/mL，4 μg/mL FK-228。均設(shè)5個(gè)復(fù)孔。24 h、48 h、72 h后每孔滴入10 μL CCK-8液，避光放置。設(shè)定酶標(biāo)儀讀數(shù)為450 nm，檢測(cè)96孔板內(nèi)的吸光度值（A），重復(fù)實(shí)驗(yàn)4次。收集數(shù)據(jù)計(jì)算細(xì)胞抑制率。

1.2.3 DNA Ladder試劑盒檢測(cè)凋亡 選擇生長(zhǎng)旺盛Tac-8113細(xì)胞，使細(xì)胞濃度為3×105個(gè)/mL置于25 cm2細(xì)胞瓶中，待細(xì)胞貼壁后，設(shè)立對(duì)照組（不加藥）及實(shí)驗(yàn)組，選擇實(shí)驗(yàn)組藥物濃度為2.0 μg/mL。作用48 h后，離心收集2×106個(gè)細(xì)胞置于1.5 mL Eppendorf管中，PBS液輕輕清洗，將沉淀物中滴入Lysis Buffer 100 μL，實(shí)驗(yàn)過(guò)程避光操作，10 s震蕩離心保留上清液，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行以下操作：滴入20 μL SolutionA、EnzymeA，輕輕搖勻在55℃恒溫1 h，加入EnzymeB 20 μL，37℃恒溫水域置1 h，滴入Precipitant 130 μL、冰乙醇950 μL，-20℃處理12 h后收集DNA，DNA用70%冷乙醇洗并干燥10 min，滴入TE Buffer 10 μL、Loading Buffer 2 μL，配置1.5%瓊脂糖凝膠，每孔加入20 μL試驗(yàn)樣品，5 V/cm下電泳3 h，在紫外燈下觀察收集照片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)學(xué)分析，本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為計(jì)數(shù)資料，細(xì)胞抑制率采用[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FK-228對(duì)Tca-8113細(xì)胞形態(tài)的觀察

在倒置顯微鏡下，未經(jīng)藥物處理的舌癌Tca-8113細(xì)胞形態(tài)為多邊形，貼壁排列整齊規(guī)整，細(xì)胞有光澤。增加FK-228藥物濃度、延長(zhǎng)FK-228藥物作用Tca-8113細(xì)胞時(shí)間，細(xì)胞外形開(kāi)始變圓、體積縮小，透光度減低，藥物作用時(shí)間越長(zhǎng)培養(yǎng)液中變形細(xì)胞漂浮越多，細(xì)胞顏色暗淡。而對(duì)照組中細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)中漂浮細(xì)胞較少。

2.2 FK-228對(duì)Tca-8113細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組比較，經(jīng)FK-228處理后的細(xì)胞數(shù)量及吸光度值隨著藥物濃度增加減少，與藥物劑量相關(guān)。隨著藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率逐漸減低見(jiàn)封三圖7。通過(guò)χ2檢驗(yàn)，24 h與48 h相比，χ2=4.06，P>0.05。24 h與48 h各濃度比較，χ2=11.314，P<0.05，48 h與72 h相比，χ2=2.196，P>0.05。48 h的抑制率分別為21.6%、38.72%、47.9%，72 h時(shí)培養(yǎng)液中有大量壞死細(xì)胞干擾抑制率所以不采取數(shù)據(jù)結(jié)果。

2.3 DNA Ladder檢測(cè)細(xì)胞凋亡

藥物濃度為2.0 μg/mL FK-228處理Tca-8113細(xì)胞48 h后細(xì)胞有凋亡發(fā)生。見(jiàn)封三圖8。

3 討論

組蛋白去乙酰酶（histone deacetylase，HDAC）是一種氨基水解酶，組蛋白去乙酰化賴氨酸殘基，用于染色質(zhì)重塑，因此在基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用。由于其異常的活性和在多種癌癥中的過(guò)度表達(dá)，HDAC被認(rèn)為是潛在的抗癌藥物靶點(diǎn)。HDACis對(duì)細(xì)胞毒性作用體現(xiàn)在正在增殖、己經(jīng)停止生長(zhǎng)的惡性腫瘤細(xì)胞，而對(duì)誘導(dǎo)正常細(xì)胞死亡的劑量是惡性腫瘤細(xì)胞10倍或更多[5]。HDACis調(diào)節(jié)組蛋白和非組蛋白的乙酰化狀態(tài)，組蛋白和非組蛋白是細(xì)胞表觀遺傳修飾的關(guān)鍵分子，HDACis通過(guò)修復(fù)DNA、抑制細(xì)胞周期、誘導(dǎo)凋亡和改變基因表達(dá)來(lái)有效地抑制增殖。目前根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)不同可分為六類：（1）短脂肪酸類如丁酸鈉；（2）親電子酮類如三氟甲基酮；（3）異羥基肟酸如SAHA；（4）環(huán)四肽類如FK-228；（5）苯甲酰胺類如MGCD0103；（6）其他類[6]。到目前為止，有四種藥物，即SAHA、FK-228、PXD-101、LBH-589已經(jīng)獲得FDA的癌癥批準(zhǔn)，部分HDACis目前正處于臨床試驗(yàn)的不同階段[7-8]。SAHA和FK-228被批準(zhǔn)用于第二線治療難治、持久或復(fù)發(fā)的皮膚T細(xì)胞淋巴瘤?；谑褂肏DACis的抗癌治療的潛在好處越來(lái)越多的證據(jù)導(dǎo)致了世界各地大量的專利申請(qǐng)[9]。

FK-228不含環(huán)氧酮基的環(huán)四肽類化合物的雙環(huán)，是從紫色素桿菌肉湯中分離得到。分子式為C24H36N4O6S2。在細(xì)胞介質(zhì)、血漿中的FK-228能穿透細(xì)胞膜從而實(shí)現(xiàn)其穩(wěn)定物理性能。有最新研究表明，免疫性疾病、炎癥的治療、抑制血管生成、抗耐藥性及神經(jīng)系統(tǒng)等疾病FK-228有明顯作用[10]。

FK-228對(duì)Tca-8113細(xì)胞的抑制增殖作用，隨著藥物濃度及時(shí)間的加長(zhǎng)，Tca-8113細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制作用，細(xì)胞變形明顯、細(xì)胞凋亡、死亡增多。其機(jī)制可能與抑制HDAC1、HDAC2，加p19INK4d和p21Waf1/Cip1的表達(dá)，抑制CDK的表達(dá)有關(guān)。DNA ladder形成與HDAC1高度促進(jìn)組蛋白乙酰化有關(guān)[11-12]。同時(shí)FK-228增加P21基因表達(dá)，減少S期細(xì)胞周期生成，細(xì)胞在G1期阻滯。組蛋白H3，H4乙?；黾?，通過(guò)非p53依賴型導(dǎo)致P21表達(dá)增加。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期滯留在G1和G2/M[13]。

本實(shí)驗(yàn)顯示，F(xiàn)K-228可以誘導(dǎo)Tca-8113細(xì)胞凋亡，凋亡原因可能是細(xì)胞凋亡的膜表面分子Fas/FasL基因啟動(dòng)，活化凋亡啟使者caspase-3、caspase-8通路，下調(diào)Fas結(jié)合蛋白樣白介素1β轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白表達(dá)，細(xì)胞骨架被重組，影響DNA結(jié)構(gòu)、翻譯、修飾誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。張旭輝等[15]研究發(fā)現(xiàn)有絲分裂檢查點(diǎn)激酶Bub1蛋白、Bubr1蛋白著絲粒定位、紡錘體檢查點(diǎn)功能受到FK-228影響，有效抑制Survivin、AuroraB，腫瘤細(xì)胞的有絲分裂受到影響，腫瘤細(xì)胞受到殺傷。

綜上所述，F(xiàn)K-228體外誘導(dǎo)Tca-8113凋亡，為今后的治療口腔鱗癌的藥物研究打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 李龍江，趙洪偉，張松濤.口腔癌的基因治療進(jìn)展[J].中華口腔醫(yī)學(xué)雜志，2008，43（3）：139-142.

[2] 張敏，趙艷華，湯曉飛，等.尼古丁對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響[J].中華口腔醫(yī)學(xué)雜志，2012，47（4）：233-237.

[3] Yamato E.High dose of histone deacetylase inhibitors affects insulin secretory mechanism of pancreatic beta cell line[J].Endocr Regul，2018，52（1）：21-26.

[4] Valdez BC，Li Y，Murray D，et al.Combination of a hypomethylating agent and inhibitors of PARP and HDAC traps PARP1 and DNMT1 to chromatin， acetylates DNA repair proteins，down-regulates NuRD and induces apoptosis in human leukemia and lymphoma cells[J].Oncotarget，2017，9（3）：3908-3921.

[5] van Oers JM，Zwarthoff EC，Rehman I，et al. FGFR3 mutations indicate better survival in invasive upper urinary tract and bladder tumours[J].Eur Urol，2009，55（3）：650-657.

[6] 陳恒屹.組蛋白去乙酰化酶抑制劑與腫瘤治療研究進(jìn)展[J].重慶醫(yī)學(xué)，2017，46（30）：4280-4282.

[7] Manal M，Chandrasekar MJ，Gomathi Priya J，et al.Inhibitors of histone deacetylase as antitumor agents：A critical review[J].Bioorg Chem，2016，67：18-42.

[8] Dong Z，Yang Y，Liu S，et al. HDAC inhibitor PAC-320 induces G2/M cell cycle arrest and apoptosis in human prostate cancer.[J]. Oncotarget，2017，9（1）：512-523.

[9] Carafa VL，Nebbioso A，Altucci L.Histone deacetylase inhibitors：Recent insights from basic to clinical knowledge & patenting of anti-cancer actions[J].Recent Pat Anticancer Drug Discov，2011，6（1）：131-145.

[10] 陳忠南.表觀遺傳學(xué)藥物FK228的藥理作用及機(jī)制[J].國(guó)際病理科學(xué)與臨床雜志，2008，28（4）：297-301.

[11] 劉俊.替加氟注射液對(duì)移行膀胱癌患者的組蛋白去乙?；?的影響及臨床分析[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2013，15：144-145.

[12] Gao L，Cheng D，Yang J，et al. Sulforaphane epigenetically demethylates the CpG sites of the miR-9-3 promoter and reactivates miR-9-3 expression in human lung cancer A549 cells[J].J Nutr Biochem，2018，56：109-115.

[13] Zhao Y，Lu S，Wu L，et al.A cetylation of p53 at lysine 373/382 by the histone deacetylase inhibitor depsipeptide induces expression of p21（Waf1/Cip1）[J].Mol Cell Biol，2006，26（7）：2782-2790.

[14] Tycko B.Epigenetic gene silencing in cancer[J].J Clin Invest，2000，105（4）：401-407.

[15] 張旭輝，趙名，陳國(guó)柱，等.組蛋白去乙酰化酶抑制劑-FK228對(duì)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞紡錘體檢查點(diǎn)的影響[J].中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2013，35（10）：1470-1476.

（收稿日期：2018-03-16）