響應(yīng)面法優(yōu)化油茶粕培養(yǎng)里氏木霉酶系活力條件及發(fā)酵工藝研究

陳曉媛 于 達(dá) 朱 凱 宋廣磊

(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，杭州 310018)

自然界中的細(xì)菌、真菌和放線菌等微生物均能產(chǎn)纖維素酶降解纖維素，但里氏木霉因其產(chǎn)酶量高、易于培養(yǎng)控制及其代謝物安全無毒，被認(rèn)為是產(chǎn)纖維素酶的良好菌株，對(duì)纖維素原料具有較高的降解力［1－2］。里氏木霉生產(chǎn)的纖維素酶具有重要的應(yīng)用價(jià)值，在提取植物材料生物活性化合物中顯示出巨大的潛力，也可用于纖維素類生物乙醇和其他生物能源的生產(chǎn)［3］;在果蔬業(yè)上，利用纖維素酶水解可溶性果膠和細(xì)胞壁［4］;在釀酒業(yè)上，促進(jìn)釋放葡萄糖，改善啤酒的質(zhì)感;另外在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥業(yè)、飼料工業(yè)［5－7］等方面都有所應(yīng)用。

油茶粕是油茶籽經(jīng)過提取油脂后的殘?jiān)?，是一種富含多種營養(yǎng)成分的副產(chǎn)品。油茶粕營養(yǎng)豐富，主要含脂肪、蛋白質(zhì)、多糖、茶皂素、粗纖維等物質(zhì)，其中粗脂肪為5% ～8%，粗蛋白為12% ～18%，糖類物質(zhì)為30% ～60%，茶皂素為10% ～14%，粗纖維為5% ～8%［8］。油茶粕主要被應(yīng)用于飼料的開發(fā)［9－10］，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中作為清塘劑［11］，還用于生產(chǎn)沼氣［12］。近幾年，研究者們分析制備油茶粕中的茶皂素［13－14］、蛋白質(zhì)［15－16］、多糖［17－18］等多種活性成分，不僅提高了油茶粕的利用率，同時(shí)也產(chǎn)生了一定程度的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)效益。但是對(duì)油茶粕纖維素鮮有研究，油茶粕的開發(fā)層次仍然較低，其價(jià)值還沒有得到充分利用。

本研究以油茶粕為原料，選擇油茶粕比例、微晶纖維素添加量、接種量和初始pH為研究因素，測(cè)定不同發(fā)酵條件下纖維素酶活力，并以微晶纖維素作為酶系誘導(dǎo)底物，比較培養(yǎng)條件對(duì)里氏木霉纖維素酶的影響，在單因素的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析，優(yōu)化以油茶粕為底物的里氏木霉發(fā)酵制備可溶性膳食纖維的工藝條件，探索酶系活力與發(fā)酵條件的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

里氏木霉(Trichodermareesei):中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，命名為Trichodermareesei CICC;油茶粕;纖維二糖;微晶纖維素;乙醇、羧甲基纖維素鈉、酒石酸鈉、3，5－二硝基水楊酸、硫酸銨、磷酸二氫鉀、亞硫酸鈉均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

303系列電熱恒溫培養(yǎng)箱;SHZ－82A水浴恒溫振蕩器;BOXUN立式壓力蒸氣滅菌器;DK－S24電熱恒溫水浴鍋;XM－800Y多功能小型粉碎機(jī);SWCJ－1D潔凈工作臺(tái);KQ－80TDB超聲波清洗器;TG18KR離心機(jī);UV－2550紫外分光光度計(jì)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 油茶粕的預(yù)處理

將油茶粕烘干后，用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，以1∶9的比例加入80%乙醇，90℃水浴4 h，為脫除油茶粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子茶皂素，不斷攪拌最大程度脫除油茶粕中的茶皂素。水浴后冷卻至室溫，抽濾取濾渣并烘干，冷藏于冰箱備用。

1.3.2 培養(yǎng)基的配制

PDA培養(yǎng)基的配制:稱取洗凈去皮后的馬鈴薯200 g，切成約1 cm3的小塊，于沸水浴30 min，用紗布過濾，加入15 g瓊脂，加熱攪拌均勻。待瓊脂完全溶解后，加入20 g葡萄糖，攪拌均勻，加蒸餾水至1 000 mL。分裝，121℃滅菌30 min，備用。

液體培養(yǎng)基的配制:葡萄糖20 g，硫酸銨5 g，磷酸二氫鉀15 g，硫酸鎂0.6 g，氯化鈣0.6 g，硫酸亞鐵0.005 g，加蒸餾水至1 000 mL。分裝，121℃滅菌30 min，備用。

1.3.3 菌株的活化

取里氏木霉(Trichodermareesei CICC)菌株的凍干管，用接種環(huán)蘸取少量菌株凍干粉，于液體培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min搖床震蕩培養(yǎng)72 h。蘸取少量菌液，劃線涂布于PDA固體培養(yǎng)基平板上，30℃，培養(yǎng)72 h。按上述方法重復(fù)2次，液體轉(zhuǎn)平板，完成菌株活化。

1.3.4 菌懸液的制備

將PDA固體培養(yǎng)基上長勢(shì)較好的綠色菌落移接到液體培養(yǎng)基中，于30℃、130 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)3 d。每隔2 h在549 nm條件下測(cè)量菌液的紫外吸光值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制菌體生長曲線。培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期后，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，鏡檢稀釋至適宜濃度，以108cfu/mL為宜。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

1.3.5.1 油茶粕比例對(duì)發(fā)酵的影響

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，初步確定油茶粕添加比例為:2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%、12.0%，微晶纖維素添加量為1.0%，接種量為12.0%，pH值為5.0，于30℃、130 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)96 h后，分別測(cè)定發(fā)酵液中纖維素酶活力。

1.3.5.2 微晶纖維素添加量對(duì)發(fā)酵的影響

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)情況，初步確定微晶纖維素添加量為:0.2%、0.6%、1.0%、1.4%、1.8%、2.2%，油茶粕比例為8.0%，接種量為 12.0%，pH 值為 5.0，于 30℃、130 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)96 h后，分別測(cè)定發(fā)酵液中纖維素酶活力。

1.3.5.3 接種量對(duì)發(fā)酵的影響

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)情況，初步確定里氏木酶的接種量為:2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%、12.0%、14.0%，油茶粕比例為8.0%，微晶纖維素添加量為1.0%，pH 為5.0，于30 ℃、130 r/min 搖床中振蕩培養(yǎng)96 h后，分別測(cè)定發(fā)酵液中纖維素酶活力。

1.3.5.4 pH 對(duì)發(fā)酵的影響

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)情況，初步選擇 pH 為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，油茶粕比例為 8.0%，微晶纖維素添加量為 1.0%，接種量為 12.0%，于 30℃、130 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)4 d后，分別測(cè)定發(fā)酵液中纖維素酶活力。

1.3.6 粗酶液的制備

發(fā)酵完成后，取發(fā)酵液在8 000 r/min的條件下離心10 min，收集上清液，即為粗酶液。獲得的粗酶液放置于0.05 mol/L的(NH4)2SO4溶液中，于4℃冰箱中保存不超過48 h。

1.3.7 纖維素酶活力的測(cè)定［19］

1.3.7.1 羧甲基纖維素酶活力(CMCA)的測(cè)定

以0.1 mol/L pH5.0的磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液配制1%羧甲基纖維素鈉(CMC－Na)底物溶液。取0.5 mL酶液加入1.5 mL CMC－Na溶液中，于40℃水浴保溫30 min，測(cè)定還原糖的含量?？瞻讓?duì)照組加等體積酶液于蒸餾水中，沸水浴10 min，滅酶活。

酶解反應(yīng)中每小時(shí)由底物產(chǎn)生1.0 mg還原糖所需的酶量定義為一個(gè)活力單位，用U/mL表示。

1.3.7.2 微晶纖維素酶活力(MCCA)的測(cè)定

在試管中加入0.25 g微晶纖維素和1.5 mL磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液，再加入0.5 mL適當(dāng)稀釋的酶液(空白對(duì)照加等體積滅活酶液)，40℃水浴反應(yīng)30 min，測(cè)定還原糖的含量。

酶解反應(yīng)中每小時(shí)由底物產(chǎn)生1.0 mg還原糖所需的酶量定義為一個(gè)活力單位，用U/mL表示。

1.3.7.3 纖維二糖酶活力(CBA)的測(cè)定

以0.1 mol/L pH5.0磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液配制0.5%纖維二糖溶液。取1.5 mL纖維二糖底物溶液，加入0.5 mL適當(dāng)稀釋的酶液(空白對(duì)照加等體積滅活酶液)，40℃水浴反應(yīng)30 min，測(cè)定還原糖的含量。

酶解反應(yīng)中每小時(shí)由底物產(chǎn)生1.0 mg還原糖所需的酶量定義為一個(gè)活力單位，用U/mL表示。

1.3.7.4 濾紙酶活力(PFA)的測(cè)定

于試管底部預(yù)先放置0.1 g新華濾紙，40℃水浴預(yù)熱5 min，然后將相同溫度下預(yù)熱5 min的適當(dāng)稀釋酶液0.5 mL(空白對(duì)照加等體積滅活酶液)和1.5 mL磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液，40℃水浴保溫30 min，測(cè)定反應(yīng)后還原糖的含量。

酶解反應(yīng)中每小時(shí)由底物產(chǎn)生1.0 mg還原糖所需的酶量定義為一個(gè)活力單位，用U/mL表示。

1.3.7.5 還原糖測(cè)定

采用3，5 －二硝基水楊酸(DNS)法［20］。

3，5－二硝基水楊酸(DNS)試劑的配制:稱取酒石酸鈉182.0 g，500 mL蒸餾水中溶解，然后加入6.3 g 3，5 －二硝基水楊酸和21.0 g NaOH，再加入5.0 g重蒸酚和5.0 g亞硫酸鈉，45℃水浴，期間不斷攪拌至完全溶解，溶液清澈透明，冷卻后，加蒸餾水定容至1 000 mL，貯于棕色瓶中，一周后即可使用，常溫保存，可保存6個(gè)月。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線:取 0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.0 mL分別置于25 mL具塞試管中，各加入3，5－二硝基水楊酸溶液(DNS)2.0 mL，5 min沸水浴(DNS在堿性條件下與還原糖反應(yīng)時(shí)生成有色化合物)，然后迅速冷卻至室溫，補(bǔ)加蒸餾水至25 mL，充分搖勻，在波長為549 nm處測(cè)定吸光度值(以空白溶液進(jìn)行調(diào)零)，以葡萄糖溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

酶解液中還原糖含量的測(cè)定:在水浴中酶解反應(yīng)后，迅速在沸水浴中加熱5 min，冷卻后加入4.0 mL DNS試劑，搖勻，沸水浴加熱5 min，然后迅速冷卻至室溫，補(bǔ)加蒸餾水至25 mL，充分搖勻。波長549 nm處測(cè)其紫外吸光度值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，計(jì)算樣品中還原糖的濃度，進(jìn)而計(jì)算纖維素酶活力。

1.3.8 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

為了確定最優(yōu)的發(fā)酵條件，運(yùn)用Box－Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在相應(yīng)的最佳單個(gè)條件的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)成四因素三水平的試驗(yàn)和響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。

1.3.9 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過對(duì)響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)得到發(fā)酵條件的結(jié)果加以驗(yàn)證，做3個(gè)平行，以此確定發(fā)酵工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以 0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mg/mL 葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，549 nm 處測(cè)定的吸光度值為縱坐標(biāo)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，在549 nm波長處，葡萄糖濃度與其吸光度值呈線性關(guān)系，得到的線性函數(shù)關(guān)系式為y=1.654 7x－0.009 8，其中 y表示 OD 值，x 表示葡萄糖濃度，R2為0.999 1，表明該曲線的線性關(guān)系良好，可用作葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線使用。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 油茶粕比例對(duì)纖維素酶活力的影響

以油茶粕作為發(fā)酵底物，設(shè)計(jì)了不同油茶粕添加量 2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%、12.0% 配制發(fā)酵培養(yǎng)基，分別測(cè)定發(fā)酵液中纖維素酶活力，探究油茶粕比例對(duì)纖維素酶活力的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 油茶粕比例對(duì)纖維素酶活力的影響

由圖2可知，油茶粕比例對(duì)4種酶活力有不同程度的影響。當(dāng)油茶粕比例為2.0% ～8.0%，隨著油茶粕添加量的增加，4種酶活力均呈升高趨勢(shì)。其中當(dāng)油茶粕比例為8.0%時(shí)，CMCA、MCCA和CBA分別達(dá)到最大值為 8.12、7.45 和 4.71 U/mL。當(dāng)油茶粕比例為 8.0% ～10.0%時(shí)，CMCA、MCCA 和 CBA呈下降趨勢(shì)，而FPA繼續(xù)上升，當(dāng)油茶粕質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.0%時(shí)，F(xiàn)PA達(dá)到最大值為4.33 U/mL。當(dāng)油茶粕比例為10.0% ～12.0%時(shí)，CMCA、MCCA 和 CBA 變化趨于平緩，而FPA呈下降趨勢(shì)。綜合考慮，8.0%可視為較佳的油茶粕比例。

2.2.2 微晶纖維素添加量對(duì)纖維素酶活力的影響

以微晶纖維素作為里氏木霉發(fā)酵的誘導(dǎo)劑，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)了微晶纖維素添加量分別為0.2%、0.6%、1.0%、1.4%、1.8%、2.2%配制發(fā)酵培養(yǎng)基，測(cè)定發(fā)酵液中纖維素酶的酶活力，探究微晶纖維素添加量對(duì)纖維素酶活力的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 微晶纖維素添加量對(duì)纖維素酶活力的影響

由圖3可知，當(dāng)微晶纖維素添加量為0.2% ～2.2%時(shí)，隨著微晶纖維素添加量的增加，4種酶活力呈先上升后下降的變化。當(dāng)微晶纖維素添加量為1.0%時(shí)，CMCA 最大值為7.31 U/mL，MCCA 最大值為8.98 U/mL，F(xiàn)PA 最大值為 5.55 U/mL，CBA 最大值為4.48 U/mL。當(dāng)微晶纖維素添加量為0.2% ～1.0%時(shí)，4種酶活力上升顯著，當(dāng)微晶纖維素添加量大于1.0%時(shí)，4種酶活力下降不顯著。綜合考慮，1.0%可視為最佳的微晶纖維素添加量。

2.2.3 接種量對(duì)纖維素酶活力的影響

一般來說，接種量與酶濃度有密切關(guān)系。不同的接種量(2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%、12.0%、14.0%)的菌種分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中(其余條件均相同)，以發(fā)酵液中纖維素酶活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探究接種量對(duì)纖維素酶活力的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，當(dāng)接種量為2.0% ～14.0%時(shí)，隨著接種量的增加，4種酶活力均先升高后下降。當(dāng)接種量為8.0%時(shí)，MCCA達(dá)到最大值為8.44 U/mL，此時(shí)，CMCA 為7.62 U/mL，F(xiàn)PA 為 4.41 U/mL，CBA為4.31 U/mL。當(dāng)接種量為 8.0% ～12.0% 時(shí)，MCCA呈下降趨勢(shì)，而CMCA繼續(xù)上升，當(dāng)接種量為12.0%時(shí)，CMCA 達(dá)到最大為 8.26 U/mL，此時(shí) MCCA 為7.83 U/mL，F(xiàn)PA 為 4.37 U/mL，CBA 為 5.50 U/mL。當(dāng)接種量為10.0%時(shí)，F(xiàn)PA達(dá)到最大值為5.24 U/mL，此時(shí) CMCA 為 7.93 U/mL，MCCA 為8.13 U/mL，CBA 為 4.71 U/mL。綜合考慮，12.0%可作為較合適的接種量。

圖4 接種量對(duì)纖維素酶活力的影響

2.2.4 pH對(duì)纖維素酶活力的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基中的pH起到調(diào)節(jié)離子酸堿度的作用，它影響著菌體生長速率和產(chǎn)酶能力，微生物只能在一定pH范圍內(nèi)條件下的生長。試驗(yàn)以不同的pH值:2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，探究其對(duì)纖維素酶活力的影響，結(jié)果如圖5。

圖5 pH對(duì)纖維素酶活力的影響

由圖5可知，當(dāng) pH 值為2.0～5.0時(shí)，隨著 pH的增大，CMCA、MCCA和FPA均呈上升趨勢(shì)，但CMCA和MCCA上升較為顯著。當(dāng)pH值為5.0時(shí)，3種酶活力均達(dá)到最大值，分別為 7.93、8.91、4.05 U/mL。當(dāng)pH 值為5.0～8.0時(shí)，隨著 pH 的增大，CMCA、MCCA和FPA均呈下降趨勢(shì)。當(dāng)pH值為2.0～6.0時(shí)，隨著pH值的增大，CBA的幾乎沒有變化，當(dāng)pH值大于6.0時(shí)，CBA呈下降趨勢(shì)。

綜合考慮，pH 5.0可作為較佳的pH條件。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化里氏木霉發(fā)酵工藝

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，油茶粕比例為8.0%、微晶纖維素添加量為 1.0%、接種量為12.0%、pH為5.0為較佳的發(fā)酵條件。運(yùn)用Box－Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在相應(yīng)的單個(gè)條件的基礎(chǔ)上，選取附近的兩個(gè)條件，確定3個(gè)水平，從而設(shè)計(jì)成四因素三水平的試驗(yàn)，見表1。

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CMCA受油茶粕比例、微晶纖維素添加量、接種量和pH這四個(gè)因素的影響，與另外3種酶活力相比，更為顯著，因此以CMCA為響應(yīng)值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)值結(jié)果見表2。

表1 Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平

表2 Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)值表

以里氏木霉的CMCA為響應(yīng)值，利用Design Expert8.0軟件進(jìn)行回歸分析和方差分析，結(jié)果見表3，擬合得到回歸方程:

CMCA=8.50+0.27A － 0.047B+0.052C －0.074D －0.11AB －0.010AC －0.028AD －0.022BC －0.067BD+0.092CD －0.47A2－0.22B2－0.093C2－0.30D2

由表3可知，模型P＜0.000 1，表示該模型達(dá)極顯著水平;失擬項(xiàng) P=0.098 6＞0.05，結(jié)果差異不顯著，說明無其他因素顯著影響本項(xiàng)研究，即模型合適。試驗(yàn)中一次項(xiàng)A、二次項(xiàng)A2和二次項(xiàng)D2均呈極顯著。各因素影響程度從大到小依次為:A＞D＞C＞B，即油茶粕比例＞pH＞接種量＞微晶纖維素添加量。本模型決定系數(shù)R2=0.950 8，說明響應(yīng)值CMCA測(cè)定值和預(yù)測(cè)值間擬合度良好，校正系數(shù)=0.901 6，說明模型能解釋90.16%的響應(yīng)值變化。

表3 CMCA方差分析

2.4 綜合優(yōu)化分析

根據(jù)回歸分析結(jié)果，運(yùn)用Design－expert 8.0尋找產(chǎn)酶的最高點(diǎn)以及相對(duì)應(yīng)的因素水平，所擬合的響應(yīng)曲面能夠比較直觀地反映各個(gè)因素之間的交互作用，以及對(duì)響應(yīng)值即CMCA的影響，極值條件在曲面的圓心處［21］。等高線可以直觀地反映出，兩個(gè)因素交互作用的顯著程度，橢圓表示兩因素交互作用顯著，而圓形則表示兩個(gè)因素交互作用不顯著［22］。

根據(jù)Design－Expert 8.0軟件優(yōu)化分析，發(fā)現(xiàn)油茶粕比例(A)與微晶纖維素添加量(B)、油茶粕比例(A)與接種量(C)、微晶纖維素添加量(B)與pH(D)和接種量(C)與pH(D)的等高線呈橢圓形，說明這些因素的交互作用較為顯著。通過對(duì)回歸方程求極值，可得出當(dāng) A=8.6%，B=0.93%，C=12.48%，D=4.9時(shí)，即油茶粕比例為8.6%，微晶纖維素添加量為 0.93%，接種量為 12.48%，pH 值為 4.9，此時(shí)模型預(yù)測(cè)的酶活力達(dá)到的最大為8.55 U/mL。

2.5 響應(yīng)面結(jié)果驗(yàn)證

按照模型得到的發(fā)酵條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，做三次平行實(shí)驗(yàn)，得到的CMCA平均值為8.47 U/mL，與理論預(yù)測(cè)值相比，相對(duì)誤差小于1%，說明該模型可以較好地反映出羧甲基纖維素酶活力的影響。此外，最優(yōu)條件下，微晶纖維素酶活力為9.28 U/mL，纖維二糖酶活力為5.05 U/mL，濾紙酶活力為5.44 U/mL。

3 討論

里氏木霉酶系水解油茶粕受多種因素的影響，如底物濃度、接種量、溫度、pH 值、發(fā)酵時(shí)間［23－24］等，通過控制這些因素，優(yōu)化發(fā)酵條件，選擇最佳的產(chǎn)纖維素酶條件。底物是菌株的主要營養(yǎng)物質(zhì)的來源，其含量直接影響著菌株的生長繁殖。接種量也對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶有一定的影響。當(dāng)接種量較低時(shí)，菌株產(chǎn)酶量較少，不利于發(fā)酵的進(jìn)行;當(dāng)接種量過高時(shí)，菌體密度過大，培養(yǎng)基營養(yǎng)成分消耗較快，造成后續(xù)發(fā)酵難以進(jìn)行，不利于發(fā)酵持續(xù)推進(jìn)。每種菌株都有其最適的生長環(huán)境，因而發(fā)酵溫度、pH值也會(huì)影響發(fā)酵產(chǎn)酶效果。另外，纖維素酶是誘導(dǎo)酶，研究發(fā)現(xiàn)槐糖、微晶纖維素、乳糖、纖維二糖對(duì)里氏木霉產(chǎn)纖維素酶均有誘導(dǎo)作用，其中以槐糖和微晶纖維素的誘導(dǎo)效果最好，但槐糖的價(jià)格較高，不適合實(shí)際應(yīng)用［25－26］。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)分油茶粕比例、微晶纖維素添加量、接種量和pH，對(duì)羧甲基纖維素酶活力、微晶纖維素酶活力、纖維二糖酶活力和濾紙酶活力都有不同程度的影響，油茶粕比例對(duì)4種酶活力影響較顯著。在單因素試驗(yàn)中，當(dāng)油茶粕比例為8.0%時(shí)，4種酶活力均達(dá)到最大。微晶纖維素添加量對(duì)4種酶活力的影響較為相似。接種量和pH值對(duì)羧甲基纖維素酶活力和微晶纖維素酶活力影響較為顯著，而對(duì)纖維二糖酶活力和濾紙酶活力的影響并不顯著。這可能是因?yàn)槔锸夏久沟睦w維素酶是一種誘導(dǎo)型的復(fù)合酶系，羧甲基纖維素酶和微晶纖維素酶在纖維素酶系列中含量較大，易于表達(dá)，而纖維二糖酶所含的比例較?。?7－29］。因此為了增強(qiáng)里氏木霉的纖維素酶活力，誘變選育出高產(chǎn)纖維素酶的突變菌株至關(guān)重要。

4 結(jié)論

以油茶粕為底物，對(duì)里氏木霉發(fā)酵進(jìn)行培養(yǎng)，研究了油茶粕比例、微晶纖維素添加量、接種量和pH對(duì)里氏木霉纖維素酶活力的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析，優(yōu)化得到發(fā)酵條件為:油茶粕比例為8.6%，微晶纖維素添加量為0.93%，接種量為12.48%，pH值為4.9。在該條件下，羧甲基纖維素酶活力為8.47 U/mL，微晶纖維素酶活力為9.28 U/mL，纖維二糖酶活力為 5.05 U/mL，濾紙酶活力為5.44 U/mL。