基于毒力基因的羅非魚無乳鏈球菌三重PCR檢測方法的建立及應用*

劉 嬋 馮 娟 謝云丹 胡萬濤 王江勇 蘇友祿

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基于毒力基因的羅非魚無乳鏈球菌三重PCR檢測方法的建立及應用*

劉 嬋1,2馮 娟2謝云丹1,2胡萬濤3王江勇2蘇友祿2①

(1. 天津農學院水產學院 天津 300384；2. 中國水產科學研究院南海水產研究所 農業(yè)農村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室 廣州 510300；3. 廣州大學生命科學學院 廣州 510006)

無乳鏈球菌()作為羅非魚主要病原，傳染力強、致死率高，部分魚從發(fā)病到死亡無明顯病癥，難以確定魚體是否攜帶該病原菌，建立適用于生產一線的無乳鏈球菌檢測技術勢在必行。根據(jù)GenBank中無乳鏈球菌透明質酸酶基因()、青霉素結合蛋白基因()和CAMP因子基因()的保守序列，設計3對特異性引物，對多重PCR的反應條件和體系進行優(yōu)化，建立基于毒力基因的羅非魚無乳鏈球菌三重PCR檢測方法，并運用該方法檢測來自廣東省不同地區(qū)的羅非魚組織樣品。構建的三重PCR檢測方法僅在無乳鏈球菌中擴增出3條特異性條帶，而在羅非魚和常見的水產病原菌菌株中均未擴增出任何條帶，表現(xiàn)出良好的特異性；以無乳鏈球菌基因組DNA濃度7.24×10–5~5.65 ng/μl為模板進行擴增，該三重PCR能檢測到的最低模板濃度為1.81×10–3ng/μl，表現(xiàn)出較高的靈敏度；運用該方法檢測188個羅非魚組織樣品，其陽性檢出率與常規(guī)細菌分離鑒定陽性率一致，以常規(guī)細菌分離鑒定為標準，對該三重PCR檢測方法進行評價，其診斷敏感性(Dse)和診斷特異性(Dsp)均為100%。結果表明，構建的三重PCR檢測方法不僅顯著提高了檢測的準確度和靈敏度，還可在同一反應中同時檢測3種無乳鏈球菌毒力基因，為無公害水產品中無乳鏈球菌的快速檢疫、水產養(yǎng)殖病害早期預警提供了一種快速、精準和高效的檢測技術。

羅非魚；無乳鏈球菌；毒力基因；三重PCR

無乳鏈球菌()也稱B簇鏈球菌(Group B streptococci, GBS)，為兼性革蘭氏陽性球菌(Rosinski-Chupin, 2013; Soto, 2015)。該菌宿主廣泛，不僅能感染包括人在內的哺乳動物，還是養(yǎng)殖魚類的重要病原(Schuchat, 1998)。羅非魚為重要的世界性養(yǎng)殖魚類，是聯(lián)合國糧農組織(FAO)向全球推廣養(yǎng)殖的優(yōu)良品種，中國羅非魚養(yǎng)殖年產量約為178萬t，占世界羅非魚總產量的三分之一以上，是水產品出口量最大的品種之一(2016中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒)。近年來，羅非魚鏈球菌病日益嚴重，無乳鏈球菌作為其主要病原，傳染力強，致死率高，由此產生的病害給羅非魚養(yǎng)殖產業(yè)帶來了巨大的經濟損失(Evans, 2008; Kayansamruaj, 2015)。

羅非魚無乳鏈球菌病發(fā)病較快，部分魚從發(fā)病到死亡無明顯病癥，較難確定魚體是否攜帶該病原菌，從而影響對病害的有效處理(程世亮等, 2016)。傳統(tǒng)的病原菌分離和生理生化鑒定等方法，由于操作繁瑣、檢測周期長，不能達到快速檢測目的(張新艷等, 2008; 盧邁新等, 2010)；普通PCR方法，一次僅能檢測1個基因，可能會造成漏檢或誤檢(Wu, 2008)；環(huán)介導等溫擴增(LAMP)方法，具有靈敏度高、反應時間短、臨床使用不需要特殊的儀器、操作簡單等優(yōu)點，但對引物設計要求比較高，有些基因可能不適用，還容易形成氣溶膠污染，造成假陽性(甘文佳等, 2010)；熒光定量PCR雖然具有較高的靈敏度，但檢測儀器昂貴，對實驗操作技術水平要求較高(Su, 2016)。因此，建立快速、精準、高效且適用于生產一線的無乳鏈球菌檢測技術勢在必行。

多重PCR在一次反應中能同時擴增多個目的片段的靶序列，具有高效、快捷、高度特異、敏感等優(yōu)勢，已經成為諸多實驗室的常規(guī)診斷方法(畢艷妮等, 2014)。目前，多重PCR方法已用于養(yǎng)殖對蝦中同時檢測6種病毒(劉飛等, 2014)。本研究以無乳鏈球菌的毒力基因即透明質酸酶基因編碼表面相關青霉素結合蛋白的基因和CAMP因子的基因為靶標，設計3對特異性引物，通過引物組合優(yōu)化建立一種快速、高效、穩(wěn)定、特異性好、靈敏度高的無乳鏈球菌三重PCR檢測方法，旨在為無乳鏈球菌的快速檢測和早期預警提供一種準確、高效的檢測技術。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

魚源無乳鏈球菌標準株(ATCC51487)和人源無乳鏈球菌標準株(ATCC BAA-1138)購于中國微生物菌種保藏中心。來源于不同年份和地區(qū)的無乳鏈球菌分離株TZQ0901(2009年分離自廣東省肇慶市)、TGZ1001(2010年分離自廣東省高州市)、TYC1101 (2011年分離自廣東省陽春市)、THZ1301(2013年分離自廣東省惠州市惠東區(qū))、GZN1501(2015年分離自廣東省廣州市)、TLC1601(2016年分離自廣東省龍川縣)均從宿主羅非魚分離獲得，海豚鏈球菌()、美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種(subsp)、糞腸球菌()、金黃色葡萄球菌()、遲緩愛德華氏菌()、創(chuàng)傷弧菌() 均由實驗室分離、鑒定并保存。

1.2 引物的設計與合成

根據(jù)GenBank中無乳鏈球菌3個特異性、和基因序列，通過Primer Premier 6.0軟件設計相應的引物對(表1)，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.3 DNA模板的制備

各實驗菌株的DNA提取按照細菌基因組DNA提取試劑盒的操作說明，并保存于–20℃?zhèn)溆谩Ａ_非魚組織中細菌DNA提取步驟，參照Su等(2016)的方法。首先取魚組織約50 mg，放入組織勻漿器中研磨，加入1000 μl TE緩沖液，制成組織勻漿液。取上述勻漿液180 μl，加入20 μl濃度為50 mg/ml的溶菌酶，30℃孵育10 min，后續(xù)步驟均參照細菌DNA提取試劑盒進行。即得到高純度的魚(魚包括體內細菌)基因組DNA，保存于–20℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 3對引物的信息

Tab.1 The information of the three pairs of primers

1.4 反應條件的優(yōu)化與建立

單一引物擴增采用25 μl反應體系：2×PCR DsMix 12.5 μl，引物F(10 μmol/L) 1.0 μl，引物R(10 μmol/L) 1.0 μl，DNA模板1.0 μl，ddH2O 9.5 μl。利用3對引物進行PCR擴增，反應體系組成：2×PCR DsMix 12.5 μl，各引物上、下游(10 μmol/L)分別為0.2~1.0 μl，DNA模板1.0 μl，補充ddH2O至25 μl。反應條件：94℃預變性4 min；94℃變性30 s，55~60℃退火30 s，72℃延伸1 min，擴增30個循環(huán)；72℃延伸10 min。然后取5 μl擴增產物，在恒壓120 V條件下，1%的瓊脂糖凝膠電泳25 min檢測結果。其中，無菌超純水代替DNA模板的擴增結果為陰性對照。根據(jù)擴增結果，選擇最佳的引物比例和退火溫度。同時，將三重PCR方法所擴增的特異性片段送北京六合華大基因科技有限公司(廣州)進行測序驗證。

1.5 特異性實驗

分別以魚源無乳鏈球菌標準株(ATCC51487)、人源無乳鏈球菌標準株(ATCC BAA-1138)、6株羅非魚無乳鏈球菌(TZQ0901、TGZ1001、TYC1101、THZ1301、GZN1501和TLC1601)、海豚鏈球菌、美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、創(chuàng)傷弧菌和遲緩愛德華菌的基因組DNA為模板，根據(jù)優(yōu)化后的多重PCR反應條件和體系進行PCR擴增。

1.6 敏感性實驗

測定提取的魚源無乳鏈球菌標準株(ATCC51487)基因組DNA濃度，將樣品濃度按照50、5–1、5–2、5–3、5–4、5–5、5–6和5–7進行梯度稀釋后分別為模板DNA，采用優(yōu)化的多重PCR反應體系和條件進行PCR擴增，確定三重PCR檢測方法所需模板的最低濃度。

1.7 應用

利用構建好的三重PCR方法，檢測來自廣東省廉江市、高州市、吳川市、開平市、惠城區(qū)和龍川縣6個不同羅非魚養(yǎng)殖區(qū)188個羅非魚組織樣品。同時，利用常規(guī)細菌分離鑒定法對每份組織樣品進行檢測，比較這2種檢測方法的結果。

1.8 無乳鏈球菌三重PCR檢測方法的評價

根據(jù)世界動物衛(wèi)生組織(OIE)《水生動物疾病診斷手冊》(2016)所規(guī)定的原則，在95%以上的置信區(qū)間、允許誤差5%范圍內對188個羅非魚組織樣品進行檢測，以常規(guī)細菌分離鑒定法為標準計算此三重PCR檢測方法的診斷敏感性(Dse)和診斷特異性(Dsp)。

2 結果

2.1 三重PCR反應體系的優(yōu)化

分別對各引物加入體系的體積和退火溫度進行優(yōu)化，優(yōu)化后的最佳退火溫度為57℃，反應體系優(yōu)化結果見表2。利用優(yōu)化后的反應體系和反應條件進行無乳鏈球菌檢測，出現(xiàn)3條特異性條帶；使用單一引物分別擴增、和基因，均出現(xiàn)1條特異性條帶，條帶位置與預期結果一致(圖1)。此外，對送測序的特異性條帶序列進行BLAST比對，與無乳鏈球菌、和基因的同源性均達到或超過99%，表明構建的三重PCR所擴增的特異性條帶是準確的。

表2 三重PCR反應體系試劑組成

Tab.2 The content of the reagent in the reaction system of a triple PCR

圖1 3對引物和單一引物PCR擴增結果

M: DL2000 bp marker；1：三重PCR的結果；2~4分別表示、和基因的擴增片段；5：陰性

M: DL2000 bp marker; Lane 1: the result of three pairs of primers; Lanes 2~4:Amplified fragments of,, and; Lane 5:Negative control

2.2 特異性檢測

特異性實驗結果顯示，魚源無乳鏈球菌(ATCC51487)、人源無乳鏈球菌(ATCC BAA-1138)以及不同年份和地區(qū)的無乳鏈球菌分離株擴增結果一致，均擴增出3條目的條帶。而以羅非魚、美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、遲緩愛德華氏菌、海豚鏈球菌、創(chuàng)傷弧菌的基因組DNA為模板均未擴增出任何條帶，與陰性對照結果相一致(圖2)。

圖2 三重PCR特異性檢測結果

M：DL2000 bp marker；1：魚源無乳鏈球菌(ATCC51487)；2：人源無乳鏈球菌(ATCC BAA-1138)；3：羅非魚基因組；4：美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種；5：糞腸球菌；6：金黃色葡萄球菌；7：遲緩愛德華氏菌；8：海豚鏈球菌；9：創(chuàng)傷弧菌；10~15：擴增使用的模板為TZQ0901、TGZ1001、TYC1101、THZ1301、GZN1501和TLC1601；16：陰性對照

M: DL2000 bp marker; Lane 1:ATCC51487; Lane 2:ATCC BAA-1138; Lane 3: Tilapia genomic DNA; Lane 4:subsp; Lane 5:; Lane 6:; Lane 7:; Lane 8:; Lane 9:; Lanes 10~15: TZQ0901, TGZ1001, TYC1101, THZ1301, GZN1501, and TLC1601 of; Lane 16: Negative control

2.3 靈敏性檢測

以無乳鏈球菌基因組DNA濃度分別為5.65、1.13、2.26×10–1、4.52×10–2、9.04×10–3、1.81×10–3、3.62×10–4和7.24×10–5ng/μl為模板進行PCR擴增，結果顯示，三重PCR能檢測到的無乳鏈球菌基因組DNA最低濃度為1.81×10–3ng/μl(圖3)。

圖3 三重PCR敏感性檢測結果

M：DL2000 bp marker；1~8：無乳鏈球菌模板濃度分別為5.65、1.13、2.26×10–1、4.52×10–2、9.04×10–3、1.81×10–3、3.62×10–4和7.24×10–5ng/μl；9：陰性對照

M: DL2000 bp marker; Lanes 1~8: Template concentration ofas 5.65, 1.13, 2.26×10–1, 4.52×10–2, 9.04×10–3, 1.81×10–3, 3.62×10–4, and 7.24×10–5ng/μl; Lane 9: Negative control

2.4 三重PCR檢測方法的應用

采自廉江、龍川、高州、吳川、開平和惠東的羅非魚樣品陽性檢出率分別為100%(4/4)、100%(8/8)、57.14%(4/7)、50%(2/4)、1.23%(2/159)和0(0/6)；總體來看，188尾羅非魚組織樣品的陽性檢出率為10.6% (20/188)，均與常規(guī)細菌分離鑒定結果相一致(表3)。

2.5 三重PCR檢測方法的評價結果

以常規(guī)細菌分離鑒定方法為標準，根據(jù)Dse和Dsp計算公式得出本研究所建立的三重PCR檢測方法的Dse和Dsp均為100%(表4)。

3 討論

羅非魚是我國主要的水產品養(yǎng)殖和出口品種之一，近幾年，由于羅非魚產品不合格(農獸藥殘留、品質不合格、微生物污染、食品添加劑超標等)，出口嚴重受阻(趙海軍等, 2015)。其中，由無乳鏈球菌帶來的病害給羅非魚養(yǎng)殖產業(yè)帶來的損失最為嚴重。水產品中微生物的檢測方法主要有生化培養(yǎng)法、免疫學法和核酸檢測法等(應曉國等, 2017)，王遠微等(2008)利用三重PCR對臨床疑似樣本的檢出率為81.8%，對人工攻毒樣本的檢出率為87.5%，兩組數(shù)據(jù)均高于用細菌分離的檢出率(40.9%和67.5%)，說明多重PCR可避免單個毒力基因進行檢測時漏檢情況的發(fā)生，同時也暗示多重PCR比細菌分離技術更靈敏。

表3 組織樣品檢測結果

Tab.3 The detection result of the tissue samples

表4 兩種不同的方法對組織樣品的檢測

Tab.4 Two different methods for detection of the tissue samples

基于PCR技術的無乳鏈球菌檢測方法大多選取靶標基因為16S~23S rRNA間區(qū)序列、sip和莢膜多糖類編碼基因等(王均等, 2011; Forsman, 1997)。無乳鏈球菌普遍存在20多種毒力基因(Lin, 2011)，透明質酸酶(Hyl)是無乳鏈球菌重要的毒力因子，有助于鏈球菌在巨噬細胞內存活并影響巨噬細胞促炎性因子的表達，在無乳鏈球菌致病過程中起關鍵作用(Wang, 2014)。青霉素結合蛋白(PBP1a)在GBS抗吞噬清除中起重要作用(Hamilton, 2006; Jones, 2000)，蔡朝陽等(2006)發(fā)現(xiàn)青霉素結合蛋白的改變與金黃色葡萄球菌對甲氧西林等β-內酰胺類抗生素以及萬古霉素等糖肽類抗生素耐藥有密切關系，影響藥物作用的靶位，阻止抗生素的殺菌作用。CAMP因子認為是具有成孔性質的分泌蛋白，在GBS致病過程中發(fā)揮重要作用(Udo, 2013)。通過基因組的數(shù)據(jù)檢索確認，不同來源的(包括人及其他動物源)無乳鏈球菌均包含上述3種毒力基因，說明它們在病原體的侵入、繁殖與擴散及抵抗機體防御中起關鍵作用(Casadevall, 2001)，因此，選擇、和毒力基因設計引物檢測羅非魚無乳鏈球菌十分必要。

多重PCR方法具有特異性好、靈敏度高的優(yōu)點，被廣泛應用于水產病原的檢測。曾偉偉等(2013)針對草魚呼腸孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)各類型毒株的保守序列，建立了GCRV的三重PCR檢測方法；危芙蓉等(2010)根據(jù)廣州管圓線蟲核糖體小亞基基因序列設計特異性引物，并與小管福壽螺的特異性引物組合，建立了檢測小管福壽螺體內廣州管圓線蟲的多重PCR方法；李晨等(2010)根據(jù)水產上常見病原菌鰻弧菌()、嗜水氣單胞菌()、遲緩愛德華氏菌()的毒力相關基因，建立了同時檢測3種菌的單管多重PCR方法。本研究中，用單一引物分別擴增、和基因，可獲得特異性擴增條帶，將上述3對引物組合并優(yōu)化出多重PCR條件和體系，可同時擴增出3條特異性條帶。Su等(2016)研究發(fā)現(xiàn)，以無乳鏈球菌的一些毒力基因(如和)為靶標設計引物進行PCR擴增，存在跟其他病原菌基因組DNA交叉反應的現(xiàn)象，而本研究中未能在其他水產動物病原菌基因組中擴增出條帶，表明所建立的三重PCR檢測方法特異性強。靈敏度測試發(fā)現(xiàn)，本研究所構建的方法可檢測到濃度為1.81×10–3ng/μl的細菌基因組DNA，比黃錦爐等(2012)構建的三重PCR檢測方法靈敏度提高了近200倍。運用本研究構建的三重PCR方法檢測廣東省各地區(qū)羅非魚組織樣品的陽性檢出率為10.6%(20/188)，與細菌分離鑒定的結果吻合，說明三重PCR在羅非魚樣品檢測過程中具有廣闊的應用前景。該三重PCR檢測方法準確性高、特異性強、靈敏度高，為羅非魚無乳鏈球菌病的診斷、大規(guī)模檢疫、流行病學調查等提供了一種快速、準確而有效的方法。

Bi YN, Song Y, Ma SQ,.Progress in the application of multiplex PCR in detection of pathogenic microorganisms.Chinese Journal of Microecology, 2014, 26(12): 1476–1478 [畢艷妮, 宋宇, 馬淑青, 等. 多重PCR技術在病原微生物檢測中的應用進展. 中國微生態(tài)學雜志, 2014, 26(12): 1476–1478]

Cai ZY. Relationship between penicillin binding protein and drug resistance of. International Journal of Laboratory Medicine, 2006, 27(4): 361–363 [蔡朝陽. 青霉素結合蛋白與金黃色葡萄球菌耐藥性關系研究. 國際檢驗醫(yī)學雜志, 2006, 27(4): 361–363]

Casadevall A, Pirofski L. Host-pathogen interactions: The attributes of virulence. Journal of Infectious Diseases, 2001, 184(3): 337–344

Cheng SL, Liu XF, Zheng W,.infection in fish. Progress in Veterinary Medicine, 2016, 37(2): 105–109 [程世亮, 劉新風, 鄭文, 等. 魚類無乳鏈球菌病. 動物醫(yī)學進展, 2016, 37(2): 105–109]

Evans JJ, Klesius PH, Bohnsack JF,. Genomic diversity ofisolates from multiple hosts and their infectivity in Nile tilapia.International Symposium on Talipia in Aquaculture, 2008(8): 109

Forsman P, Tilsala-Timisj?rvi A, Alatossava T. Identification of staphylococcal and streptococcal causes of bovine mastitis using 16S-23S rRNA spacer regions. Microbiology, 1997, 143(11): 3491–3500

Gan WJ, Hu XC. LAMP and its use in gene diagnosis of pathogens. Journal of Pathogen Biology, 2010, 5(2): 143–145 [甘文佳, 胡旭初. LAMP技術及其在病原基因診斷中的應用. 中國病原生物學雜志, 2010, 5(2): 143–145]

Hamilton A, Popham DL, Carl DJ,. Penicillin-binding protein 1a promotes resistance of group B streptococcus to antimicrobial peptides. Infection & Immunity, 2006, 74(11): 6179–6187

Huang JL, Wang KY, Xiao D,. The development and application of a triplex PCR method for rapid detection of.Oceanologia et Limnologia Sinica, 2012, 43(2): 254–261 [黃錦爐, 汪開毓, 肖丹, 等. 無乳鏈球菌()三重PCR快速檢測方法的建立與應用. 海洋與湖沼, 2012, 43(2): 254–261]

Jones AL, Knoll KM, Rubens CE,. Identification ofvirulence genes in the neonatal rat sepsis model using signature-tagged mutagenesis. Molecular Microbiology, 2000, 37(6): 1444–1455

Kayansamruaj P, Pirarat N, Kondo H,comparison between pathogenicisolated from Nile tilapia in Thailand and fish-derived ST7 strains. Infection Genetics & Evolution Journal of Molecular Epidemiology & Evolutionary Genetics in Infectious Diseases, 2015, 36: 307–314

Li C, Wang XH, Huang J.Multiplex PCR for the detection of three main aquatic pathogens. Progress in Fishery Sciences, 2010, 31(3): 100–106 [李晨, 王秀華, 黃倢. 3種主要水產病原菌多重PCR檢測方法的建立. 漁業(yè)科學進展, 2010, 31(3): 100–106]

Lin FP, Lan R, Sintchenko V,. Computational bacterial genome-wide analysis of phylogenetic profiles reveals potential virulence genes of. PLoS One, 2011, 6(4): e17964

Liu F, Zhang BC, Zhang XH,.Multiplex PCR assay for simultaneous detection of six viruses in shrimp. Progress in Fishery Sciences,2014, 35(1): 60–67 [劉飛, 張寶存, 張曉華, 等. 對蝦6種病毒多重PCR檢測方法的建立. 漁業(yè)科學進展, 2014, 35(1): 60–67]

Lu MX, Li J, Ye X,. Identification and characterizations ofisolated from tilapia cultured inGuangdong and Hainan provinces.Microbiology, 2010, 37(5): 766–774 [盧邁新, 黎炯, 葉星, 等. 廣東與海南養(yǎng)殖羅非魚無乳鏈球菌的分離、鑒定與特性分析. 微生物學通報, 2010, 37(5): 766–774]

Rosinski-Chupin I, Sauvage E, Mairey B,. Reductive evolution inand the emergence of a host adapted lineage. BMC Genomics, 2013, 14(1): 252

Schuchat A. Epidemiology of group B streptococcal disease in the United States: Shifting paradigms. Clinical Microbiology Reviews, 1998, 11(3): 497–513

Soto E, Wang R, Wiles J,. Characterization of isolates of from diseased farmed and wild marine fish from the U.S. Gulf Coast, Latin America, and Thailand. Journal of Aquatic Animal Health, 2015, 27(2): 123–134

Su YL, Feng J, Li YW,. Development of a quantitative PCR assay for monitoring, colonization and tissue tropism in experimentally infected tilapia. Journal of Fish Diseases, 2016, 39: 229–238

Udo EE, Boswihi SS, Alsweih N. Genotypes and virulence genes in group B streptococcus isolated in the maternity hospital, Kuwait. Medical Principles and Practice, 2013, 22(5): 453–457

Wang J, Wang KY, Xiao D,.Development of double PCR for rapid detection ofisolated from tilapia.Chinese Veterinary Science, 2011, 41(5): 496–502 [王均, 汪開毓, 肖丹, 等. 羅非魚源無乳鏈球菌雙重PCR快速檢測方法的建立. 中國獸醫(yī)科學, 2011, 41(5): 496–502]

Wang YW, Tang C, Yu XH,. Detecting pathogenicin fish by triplex PCR. Acta Microbiologica Sinica, 2008, 48(7): 947–951 [王遠微, 湯承, 于學輝, 等. 三重PCR檢測魚類致病性嗜水氣單胞菌. 微生物學報, 2008, 48(7): 947–951]

Wang Z, Guo C, Xu Y,. Two novel functions of hyaluronidase fromare enhanced intracellular survival and inhibition of proinflammatory cytokine expression. Infection & Immunity, 2014, 82(6): 2615–2625

Wei FR, Liu HX, Lv S,Multiplex PCR assay for the detection oflarvae in. China Journal of Parasitology and Parasitic Diseases, 2010, 28(5): 355–358 [危芙蓉, 劉和香, 呂山, 等. 用多重PCR技術檢測小管福壽螺體內廣州管圓線蟲幼蟲. 中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志, 2010, 28(5): 355–358]

Wu J, Liu Y, Hu S,. Development of a rapid PCR test for identification ofin milk samples collected on filter paper disks. Asian Australasian Journal of Animal Sciences, 2008, 21(1): 124–130

Ying XG, Yuan N, Deng SG,.Research progress on detection techniques of aquatic products. Journal of Food Safety and Quality, 2017, 8(4): 1196–1202 [應曉國, 袁寧, 鄧尚貴, 等. 水產品質量安全檢測技術研究進展. 食品安全質量檢測學報, 2017(4): 1196–1202]

Zeng WW, Wang Q, Wang YY,. Establishment of multiplex PCR for detection of grass carp reovirus and its application.Journal of Fishery Sciences of China, 2013, 20(2): 419–426 [曾偉偉, 王慶, 王英英, 等. 草魚呼腸孤病毒三重PCR檢測方法的建立及其應用. 中國水產科學, 2013, 20(2): 419–426]

Zhang XY, Fan HP, Zhong QF,.Isolation, identification and pathogenicity offrom tilapia. Journal of Fisheries of China, 2008, 32(5): 772–779 [張新艷, 樊海平, 鐘全福, 等. 羅非魚無乳鏈球菌的分離、鑒定及致病性研究. 水產學報, 2008, 32(5): 772–779]

Zhao HJ, Yang BB, Hao Y,. The actualities and countermeasures of export tilapia in China.Journal of Food Safety and Quality, 2015, 6(12): 5100–5106 [趙海軍, 楊彬彬, 郝躍, 等. 我國羅非魚出口現(xiàn)狀及對策. 食品安全質量檢測學報, 2015, 6(12): 5100–5106]

The Application and Detection ofIsolated from Tilapia with a Triple PCR Based on Virulence Genes

LIU Chan1,2, FENG Juan2, XIE Yundan1,2, HU Wantao3, WANG Jiangyong2, SU Youlu2①

(1. College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384; 2. Key Laboratory of South China Sea Fishery Resources Exploitation & Utilization, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300; 3. School of Life Science, Guangzhou University, Guangzhou 510006)

has become one of the most important emerging pathogens with strong infectivity and virulence, causing high mortalities and large economic losses in tilapia farming industries in China. There are no obvious symptoms in some tilapia infected by, so it can be difficult to determine if a fish carried the pathogen. Thus, it was necessary to establish an effective method for detection ofin the breeding process of tilapia. Three pairs of specific primers were designed based on the conserved sequence of, andgenes encoding hyaluronidase, penicillin binding protein, and CAMP factor ofpublished in GenBank, respectively. After the optimization of the reaction conditions and reaction system of multiplex PCR, the triple PCR method based on the three virulence genes was developed for detection ofisolated from tilapia. Furthermore, the established method was applied to detect tissue samples of tilapia collected from different farming areas in Guangdong Province. The detection result ofonly amplified three specific bands, however there were no bands in the host and the other common bacterial pathogen strains in aquaculture, which indicated that the method had good specificity. The dynamic range of template concentration ofwas 7.24×10-5~5.65 ng/μl. Sensitivity tests showed that the detection limit of thein genomic DNA was 1.81×10-3ng/μl, with a higher sensitivity. The positive rate for detection of 188 tissue samples isolated from tilapia using the triple PCR method was consistent with the positive rate by the conventional bacterial identification method. The triple PCR method was evaluated with the conventional method as the standard; diagnostic sensitivity (Dse) and diagnostic specificity (Dsp) were 100%. In summary, the results showed that the triple PCR method not only improved the accuracy and sensitivity of the detection, but also detected three virulence genes ofin the same reaction system. Therefore, this method provided a rapid, accurate, and efficient detection technology for monitoringinfection in harmless aquatic products and early warning of aquaculture diseases.

Tilapia;; Virulence gene; Triple PCR

* 國家自然科學基金(31502210)、廣州市珠江科技新星(201610010015)、廣東省級魚病防治專項(2016-302)、廣東省自然科學基金(2015A030313688)和“廣東特支計劃”科技青年拔尖人才(2016TQ03N275)共同資助 [This work was supported by National Natural Science Foundation of China (31502210), Pearl River S&T Nova Program of Guangzhou (201610010015), Special Funds for Fish Diseases of Guangdong Province (2016-302), Natural Science Foundation of Guangdong Province (2015A030313688), and Youth Science and Technology Innovation Talents Funds in Special Support Plan for High Level Talents in Guangdong Province (2016TQ03N275)]. 劉 嬋, E-mail: 784102490@qq.com

蘇友祿，副研究員，E-mail: suyoulu@scsfri.ac.cn

SU Youlu, E-mail: suyoulu@scsfri.ac.cn

2017-07-07,

2017-07-31

10.19663/j.issn2095-9869.20170707001

劉嬋, 馮娟, 謝云丹, 胡萬濤, 王江勇, 蘇友祿. 基于毒力基因的羅非魚無乳鏈球菌三重PCR檢測方法的建立及應用. 漁業(yè)科學進展, 2018, 39(5): 130–136 Liu C, Feng J, Xie YD, Hu WT, Wang JY, Su YL. The application and detection ofisolated from tilapia with a triple PCR based on virulence genes. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(5): 130–136

S942

A

2095-9869(2018)05-0130-07

(編輯 馮小花)