基因工程技術(shù)在甜瓜屬作物分子育種中的應(yīng)用與發(fā)展

段莉莉　朱拼玉　李季　陳勁楓

摘 要： 黃瓜和甜瓜均屬于葫蘆科甜瓜屬作物，作為重要的園藝作物在全世界廣泛種植。我國黃瓜和甜瓜的種植面積與產(chǎn)量均居世界第一。不斷培育優(yōu)質(zhì)高抗的新品種是促進(jìn)產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的重要推動力，但常規(guī)育種存在轉(zhuǎn)育效率低、育種周期長等問題。多年來瓜類育種家們一直致力于甜瓜屬作物基因工程育種方法的探索和研究，隨著黃瓜和甜瓜在基因組研究領(lǐng)域取得了重大突破，大量重要功能基因的發(fā)掘與克隆為基因工程育種帶來了機(jī)遇，也促使甜瓜屬作物基因工程技術(shù)研究進(jìn)入了快速發(fā)展的階段。就基因工程技術(shù)在甜瓜屬作物分子遺傳育種研究中的應(yīng)用和發(fā)展現(xiàn)狀、存在問題以及未來發(fā)展趨勢等進(jìn)行了探討。

關(guān)鍵詞： 黃瓜； 甜瓜； 基因工程； 分子遺傳

Application and development of genetic engineering technology in molecular breeding of melon crops

DUAN Lili， ZHU Pinyu， LI Ji， CHEN Jinfeng

（State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement， College of Horticulture， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， Jiangsu， China）

Abstract： Cucumber and melon， which belong to the Cucumis family， are widely cultivated in the world as important horticultural crops. The planting areas and yields of cucumber and melon in China are the highest in the world. Continuous cultivation of new varieties with high quality and high resistance is an important impetus to promote the sustainable development of the agriculture. However， conventional breeding has many problems such as low efficiency transformation and long breeding cycle. For many years， breeders have been devoting themselves to the exploration and research on the genetic engineering breeding methods of Cucumis. Since major breakthroughs have been made in genomics research of cucumbers and melons， a large number of important functional genes have been discovered and cloned， which brings opportunities for genetic engineering breeding and prompts the development of research on the transgenic technology of Cucumis. This paper aims at exploring the application， development status， existing problems and future trends of transgenic technology in molecular genetics and breeding of Cucumis.

Key words：Cucumber； Melon； Genetic engineering； Molecular genetics

黃瓜（Cucumis sativus L.）和甜瓜（Cucumis melo L.）屬于葫蘆科（Cucurbitaceae）甜瓜屬（Cucumis），均是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物。中國是世界上黃瓜、甜瓜種植歷史最為悠久、栽培面積極大的生產(chǎn)國。據(jù)2014年聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，中國黃瓜和甜瓜的栽培面積約占世界種植面積的74%和36.96%，其產(chǎn)量與產(chǎn)值均居世界首位。然而在長期的農(nóng)作物馴化和育種工作中，許多栽培品種的遺傳變異資源已嚴(yán)重匱乏，同時黃瓜和甜瓜在生產(chǎn)上極易發(fā)生嚴(yán)重的病蟲害。例如黃瓜霜霉病，目前已經(jīng)蔓延到了80個國家，其中50個國家的黃瓜生產(chǎn)受到了嚴(yán)重影響[1-4]。蔓枯病能導(dǎo)致葫蘆科中至少12個屬23個種的作物感病，是甜瓜的主要病害，大田發(fā)病率可達(dá)20%～30%，在連作地或溫室發(fā)病率高達(dá)80%[5]。同時隨著社會經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，消費(fèi)者對瓜類產(chǎn)品的品質(zhì)要求也日益提高，因此甜瓜屬作物產(chǎn)業(yè)的持續(xù)性發(fā)展迫切需要培育出更多優(yōu)質(zhì)多抗的新品種。目前基于常規(guī)育種技術(shù)的黃瓜、甜瓜新品種培育一直存在遺傳基礎(chǔ)狹窄、育種周期長甚至生殖隔離等問題[6]，無法滿足當(dāng)前產(chǎn)業(yè)飛速發(fā)展的要求。另一方面，隨著黃瓜[7]和甜瓜[8]基因組測序的完成，甜瓜屬作物研究已進(jìn)入后基因組時代，雖然大量基因的預(yù)測與注釋為甜瓜屬作物育種改良奠定了重要基礎(chǔ)，但重要農(nóng)藝性狀基因的功能驗(yàn)證與快速轉(zhuǎn)育也面臨著巨大的挑戰(zhàn)?；蚬こ碳夹g(shù)是實(shí)現(xiàn)基因在物種間快速轉(zhuǎn)育的有效途徑，也是基因功能驗(yàn)證的重要方法。自20世紀(jì)90年代，甜瓜屬作物基因工程技術(shù)研究已表現(xiàn)出良好的發(fā)展勢頭，但甜瓜屬作物的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)依舊存在再生體系建立困難、轉(zhuǎn)化率低、嵌合率高等方面的問題。筆者將就基因工程技術(shù)在甜瓜屬作物分子遺傳育種研究中的應(yīng)用和發(fā)展現(xiàn)狀、存在的問題以及未來發(fā)展趨勢等進(jìn)行探討。

1 甜瓜屬作物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀

植物遺傳轉(zhuǎn)化方法多種多樣，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、花粉管通道法和基因槍法等成熟技術(shù)已經(jīng)在甜瓜屬作物遺傳轉(zhuǎn)化中得到了成功應(yīng)用。然而再生體系建立困難、轉(zhuǎn)化率低、遺傳穩(wěn)定性差及嵌合體等問題在甜瓜屬作物轉(zhuǎn)化中依然存在。多年以來，研究者嘗試進(jìn)一步優(yōu)化現(xiàn)有體系，同時也在不斷探索新的轉(zhuǎn)化方法，例如顯微注射法、電擊穿孔轉(zhuǎn)化法、病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法等。

1.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化法具有外源基因插入拷貝數(shù)低、遺傳穩(wěn)定性好、操作相對簡單和價格低廉等優(yōu)點(diǎn)，早在上世紀(jì)90年代就已經(jīng)在甜瓜屬作物中成功應(yīng)用。Raharjo等[9]借助3種根癌農(nóng)桿菌菌株，將水稻幾丁質(zhì)酶的相關(guān)基因（RCC2）轉(zhuǎn)入黃瓜，通過分析證實(shí)了轉(zhuǎn)基因黃瓜系中該基因的正常表達(dá)，且在后代中穩(wěn)定遺傳。Bordas等 [10]用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將hal基因成功轉(zhuǎn)入甜瓜基因組并正常轉(zhuǎn)錄。

高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系依賴于較高的外植體再生頻率。然而甜瓜屬作物與擬南芥、煙草、番茄等作物相比，大多數(shù)基因型的外植體分化再生頻率較低，限制了農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)在甜瓜屬作物育種及后基因組學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用，因此建立高效穩(wěn)定的黃瓜、甜瓜離體再生體系是亟需解決的問題。侯愛菊等[11]創(chuàng)建的再生體系是以‘長春密刺為基因型、子葉節(jié)為外植體，獲得了較高的再生率和子葉節(jié)的利用率。但仍然存在基因型差異明顯和頂部節(jié)間雄花簇生等問題。蘇紹坤等[12]發(fā)現(xiàn)pH值較低的分化培養(yǎng)基有利于黃瓜子葉節(jié)的分化，pH 5.2條件下的誘芽率是pH 5.8的2倍，達(dá)到了36.7%。肖守華等[13]以厚皮甜瓜的子葉為外植體，建立了高效的甜瓜再生體系，不定芽誘導(dǎo)率可達(dá)92.6%，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將小麥γ-硫堇蛋白基因轉(zhuǎn)入了甜瓜。迄今，已建立的甜瓜高效離體再生體系包括采用子葉、下胚軸以及真葉等外植體[14]。農(nóng)桿菌侵染率、抗氧化劑或有機(jī)物的添加方式以及固化劑類型等同樣對甜瓜屬作物的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化效果有著密切影響。寧宇等[15]發(fā)現(xiàn)適宜濃度的乙酰丁香酮（AS）可以增強(qiáng)農(nóng)桿菌侵染黃瓜外植體的效果。王燁等[16]也發(fā)現(xiàn)同時添加抗氧化劑硫辛酸（LA）和乙酰丁香酮（AS）與單獨(dú)使用這2種試劑相比能顯著提高農(nóng)桿菌的侵染效率，可使黃瓜抗性芽的誘導(dǎo)率由28.3%提高到86.7%。方麗等[17]發(fā)現(xiàn)AS并不能顯著改善農(nóng)桿菌侵染甜瓜外植體的效率，但在分化培養(yǎng)基中添加0.5 mg·L-1 Ag+時對轉(zhuǎn)化率具有明顯促進(jìn)作用，轉(zhuǎn)化率可達(dá)35.6%，遠(yuǎn)高于對照的19.6%。李建欣等[18]研究發(fā)現(xiàn)添加Ag+也能夠極大地提高黃瓜再生芽率和芽增殖數(shù)。李蕾等[19]發(fā)現(xiàn)，將脫乙酰吉蘭糖膠取代瓊脂為培養(yǎng)基固化劑，并添加1.5 g·L-1水解酪蛋白可以顯著提高抗性芽誘導(dǎo)率。恰當(dāng)?shù)目股剡x擇壓力是平衡抗性芽誘導(dǎo)率和假陽性芽形成率的關(guān)鍵。蘇紹坤等[12]認(rèn)為30 mg·L-1的卡那抗生素濃度就已經(jīng)完全抑制黃瓜非抗性芽的分化。但大部分黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化研究都將卡那霉素的質(zhì)量濃度提高到100 mg·L-1，以降低假陽性率[15，18-19]。與黃瓜相比，甜瓜對卡那霉素耐性高，篩選濃度可高達(dá)150 mg·L-1[17]。潮霉素抗性標(biāo)簽也經(jīng)常用于甜瓜屬作物遺傳轉(zhuǎn)化，王學(xué)斌等[20]認(rèn)為潮霉素篩選的最適濃度為6 mg·L-1。除了抗生素壓力篩選外，研究者還開展了生物安全標(biāo)記在甜瓜屬遺傳轉(zhuǎn)化里的應(yīng)用研究。例如基于木糖異構(gòu)酶基因（XylA）構(gòu)建的木糖篩選體系，已經(jīng)在黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化中得到了成功應(yīng)用[21]。

1.2 花粉管通道法

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法為甜瓜屬作物提供了一種常規(guī)且有效的轉(zhuǎn)基因途徑，但依賴于高效再生體系的建立，因此在研究和優(yōu)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的同時，也開展了其他轉(zhuǎn)基因途徑的研究?；ǚ酃芡ǖ兰夹g(shù)因具有操作簡單、成本低等優(yōu)勢，被證明是一種可用于黃瓜轉(zhuǎn)基因育種的有效方法[22]。目前花粉管通道法在黃瓜上的應(yīng)用主要采用切柱頭滴加法和子房注射法。Zhou等[23]通過該方法成功地將外源海島棉D(zhuǎn)NA導(dǎo)入陸地棉基因組中，培育出了抗枯萎病的栽培新品種。目前甜瓜屬作物的花粉管通道法主要采用切柱頭滴加法和子房注射法。研究發(fā)現(xiàn)，授粉時間是甜瓜屬作物花粉管通道轉(zhuǎn)化法的主要影響因素。哈斯阿古拉等[24]以甜瓜品種‘河套蜜瓜為受體材料，在授粉后的不同時間段切去柱頭滴加DNA溶液，其中授粉7 h后滴加 DNA溶液所獲得的轉(zhuǎn)化率最高，為28.3%。張文珠等[25]通過對子房涂抹、切割柱頭以及子房注射這3種花粉管通道法的轉(zhuǎn)化成果進(jìn)行比較，證實(shí)了后2種常用技術(shù)的坐瓜率和結(jié)籽率都顯著高于子房涂抹法，2者的轉(zhuǎn)化率分別是 0.05%和0.11%，而子房涂抹法沒有得到轉(zhuǎn)基因植株。同時研究者們發(fā)現(xiàn)，花粉管通道技術(shù)的效果主要受到授粉后處理時間的制約。Zhang等[26]研究發(fā)現(xiàn)，甜瓜在授粉24 h后對授粉子房進(jìn)行處理效果最好，而哈斯阿古拉等[24]認(rèn)為，在甜瓜授粉后7 h對子房進(jìn)行菌液注射效果最好。由于甜瓜屬作物的柱頭很大，使用該方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化較為方便，但與此同時，轉(zhuǎn)化率會受到制約，需要精確掌握授粉后的時間，同時也具有易受到環(huán)境條件的影響、整合不穩(wěn)定、僅限于開花時期應(yīng)用等缺點(diǎn)。近幾年來，研究者們對于花粉管通道法在黃瓜上的應(yīng)用還具有很大的爭論，因?yàn)樵诜肿铀讲]有確切的證據(jù)。

1.3 基因槍法

基因槍轉(zhuǎn)化法又稱微彈轟擊法、粒子轟擊法（particle bombardment），是將載有外源DNA的鎢或金顆粒加速后射入受體細(xì)胞中的一種遺傳物質(zhì)導(dǎo)入技術(shù)，是以高壓氣體和高壓放電為轉(zhuǎn)化力量來源，用微粒對植物組織進(jìn)行轟擊而將其上的外源基因帶入到植物細(xì)胞內(nèi)。Chee等[27]首次通過微粒轟擊法將Nos-NPTII基因轉(zhuǎn)移到黃瓜的胚性愈傷組織中，獲得了107株獨(dú)立再生的黃瓜植株。Kodama等[28]也利用該技術(shù)將發(fā)根基因（rol）轉(zhuǎn)入黃瓜，獲得了不需要外源激素就可以正常生根的轉(zhuǎn)基因植株，增強(qiáng)了生根的效果，提高了黃瓜的逆境生存能力。基因槍轉(zhuǎn)化法的優(yōu)點(diǎn)在于可以通過工作電壓的改變來精確把握粒子射入細(xì)胞的速度和深度，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)各類器官和組織的轉(zhuǎn)化，且轉(zhuǎn)化效率較高、無宿主限制、受體類型廣泛、可控度高，而且其載體質(zhì)粒的構(gòu)建也相對簡單，因此也逐漸成為轉(zhuǎn)基因研究中應(yīng)用較為廣泛的一種方法。但是此種方法成本較高、儀器昂貴，而且也要通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)形成再生出植株。所以該方法在實(shí)際應(yīng)用中也受到某些方面的限制，但也可以與其他轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)合使用。Gonsalves等[29]使用該轉(zhuǎn)基因技術(shù)與農(nóng)桿菌技術(shù)，把黃瓜花葉病毒的白葉銹菌蛋白基因?qū)胩鸸掀贩N中，得到了大量的轉(zhuǎn)化后的四倍體或混合倍性植株，同時與非轉(zhuǎn)基因植株相比較轉(zhuǎn)基因植株對黃瓜花葉病毒表現(xiàn)出一定的抗性。目前，基因槍法在甜瓜屬作物中主要用于瞬時表達(dá)和亞細(xì)胞定位。徐冉等[30]通過該技術(shù)把黃瓜α-半乳糖苷酶基因EGFP導(dǎo)入黃瓜愈傷組織細(xì)胞，結(jié)果顯示，該基因在整個細(xì)胞中都會表達(dá)。俞婷等[31]利用基因槍法將含有熒光蛋白（GFP）標(biāo)記基因的黃瓜抗白粉病基因Csa1M064780.1導(dǎo)入到受體細(xì)胞進(jìn)行定位，結(jié)果表明，該基因位于細(xì)胞核和細(xì)胞膜上，同時也發(fā)現(xiàn)該基因僅在細(xì)胞膜上具有較高的表達(dá)量。

1.4 新技術(shù)方法研究

除了農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、花粉管通道法、基因槍法之外，近年一些新的技術(shù)也逐漸被應(yīng)用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化，例如顯微注射法、DNA浸胚法、病毒介導(dǎo)的間接轉(zhuǎn)化法、電擊穿孔轉(zhuǎn)化法、PEG介導(dǎo)法和基因編輯技術(shù)等。顯微注射法是一種成熟的、簡單的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，是在顯微鏡下通過微管向受體細(xì)胞注射外源的遺傳物質(zhì)。顯微注射法最先是在動物細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化方面得到了較成功的應(yīng)用，目前在動植物中都有成功應(yīng)用的案例。Baskaran等[32]利用含有黃瓜花葉病毒的農(nóng)桿菌菌株對莖尖分生組織（SAM）進(jìn)行了顯微注射，同時檢測到了黃瓜花葉病毒抗性反應(yīng)，說明顯微注射法可以用于黃瓜的遺傳轉(zhuǎn)化。DNA浸胚法是指將供試的種胚浸泡在外源 DNA溶液中，利用滲透作用將外源基因?qū)敕N胚細(xì)胞中并使其穩(wěn)定地整合表達(dá)與遺傳。近年來，研究者通過DNA浸胚法獲得了大量水稻、玉米、棉花的變異材料和品系[33]。雖然甜瓜屬作物中尚未有關(guān)于DNA浸胚法的研究報道，但是在葫蘆科其他瓜類作物中DNA浸胚法得到了成功應(yīng)用，肖光輝等[34]利用 DNA浸胚技術(shù)把瓠瓜的遺傳物質(zhì)導(dǎo)入西瓜的基因組中，成功獲得了性狀產(chǎn)生變異的轉(zhuǎn)基因植株，且在T2代中出現(xiàn)了許多新的表型，例如果實(shí)外觀、種子形態(tài)及顏色等。病毒介導(dǎo)的間接轉(zhuǎn)化法、電擊穿孔轉(zhuǎn)化法和PEG介導(dǎo)法等在水稻、小麥、玉米等[35-37]作物中獲得了成功應(yīng)用。雖然這些遺傳轉(zhuǎn)化方法在甜瓜屬作物中尚未有研究，但為今后甜瓜屬作物高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立提供了更多途徑?；蚓庉嫾夹g(shù)是近年來發(fā)展起來的，可以對基因組完成精確修飾的一種技術(shù)。該技術(shù)具有快速制造新的轉(zhuǎn)基因模型等優(yōu)點(diǎn)，已逐漸在甜瓜屬作物中得到了成功的應(yīng)用。其中CRISPR/CAS9技術(shù)試驗(yàn)設(shè)計簡單，在推動生物基因改造等領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用[38]。劉華威等[39]認(rèn)為高效穩(wěn)定的CRISPR技術(shù)將與二代測序技術(shù)相結(jié)合，在甜瓜屬作物對黃瓜綠斑駁花葉病毒病（CGMMV）的控制和防御方面具有廣闊的應(yīng)用前景，并有可能得到有效、甚至是徹底的控制。王雪等[40]利用CRISPR/CAS9系統(tǒng)將甜瓜品種‘老漢瓜ACC合成酶基因成功敲除，改善了該品種的耐貯運(yùn)性。

2 甜瓜屬作物基因工程育種現(xiàn)狀

自20世紀(jì)90年代開始，育種家便開始利用基因工程技術(shù)針對甜瓜屬作物的品質(zhì)、抗性和豐產(chǎn)性開展了遺傳改良研究。

2.1 品質(zhì)改良

果實(shí)品質(zhì)包括外觀品質(zhì)和風(fēng)味品質(zhì)，其中風(fēng)味品質(zhì)一直是甜瓜屬作物育種研究的重點(diǎn)。陳秀蕙等[41]應(yīng)用花粉管通道法在黃瓜自花授粉后直接導(dǎo)入菠蘿的總DNA，獲得的轉(zhuǎn)化植株雖然在外部形態(tài)上沒有明顯的變化，但在含糖量等性狀上存在不同程度的差異。Szwacka等[42]通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將非洲竹芋的甜蛋白基因thaumati轉(zhuǎn)入黃瓜基因組中，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化后的黃瓜果實(shí)甜味增加，并且隨著該基因表達(dá)量的不斷增加，果實(shí)中的甜味也漸漸增強(qiáng)。

甜瓜轉(zhuǎn)基因育種研究關(guān)注較多的是含糖量和耐貯運(yùn)品質(zhì)。李曉榮[43]用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將 ACC脫氨酶基因?qū)胄陆芄系?個品種‘皇后和‘卡拉克塞（伽師瓜），乙烯測定結(jié)果初步證明轉(zhuǎn)基因植株對乙烯的生成有抑制作用，因此延長了轉(zhuǎn)基因甜瓜的貯藏期。樊繼德等[44]用子房注射法將甜瓜反義酸性轉(zhuǎn)化酶基因?qū)牒衿ぬ鸸献越幌怠?1-3果實(shí)中，T1代轉(zhuǎn)基因植株果實(shí)的可溶性總糖含量和蔗糖含量顯著提高，但是果糖和葡萄糖含量略有降低，酸性轉(zhuǎn)化酶活性比對照明顯降低。Hao等[45]利用花粉管通道法將反義ACC氧化酶構(gòu)建載體轉(zhuǎn)入甜瓜，將轉(zhuǎn)基因果實(shí)與非轉(zhuǎn)基因果實(shí)在室溫下貯存12 d后的表型做對比，結(jié)果顯示反義ACC氧化酶轉(zhuǎn)基因果實(shí)的表型明顯強(qiáng)于非轉(zhuǎn)基因果實(shí)。

2.2 抗性改良

2.2.1 抗病性改良 日益嚴(yán)重的病蟲害成為甜瓜屬作物生產(chǎn)中面臨的重要問題，發(fā)掘并利用優(yōu)異的抗病基因成為今后甜瓜屬作物育種研究的重要內(nèi)容。轉(zhuǎn)基因技術(shù)不但可以高效地將同種內(nèi)的抗病基因?qū)肽繕?biāo)作物，而且可以打破生殖隔離，有效利用種屬間優(yōu)異抗病基因。Gonsalves等[29]將黃瓜花葉病毒外殼蛋白基因成功導(dǎo)入甜瓜，觀察到轉(zhuǎn)基因甜瓜對黃瓜花葉病毒病具有一定的抗性。鄧立平等[46]采用花粉管通道法，將抗霜霉病基因?qū)朦S瓜，獲得了霜霉病病情指數(shù)較對照降低15%～25%的穩(wěn)定突變新品系‘CJ90-40。何鐵海等[47]將CMV-CP基因轉(zhuǎn)入黃瓜基因組成功獲得了轉(zhuǎn)基因抗病植株。Galon等[48]把可能與黃瓜果實(shí)斑駁花葉病毒相關(guān)的遺傳片段轉(zhuǎn)入黃瓜，增加了轉(zhuǎn)化株系的相關(guān)抗性。田花麗[49]將銀杏抗菌蛋白基因Ginkbilobin-2（Gk-2）通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入黃瓜基因組中，轉(zhuǎn)基因植株對黃瓜枯萎病具有較好的抗病性，可明顯推遲黃瓜枯萎病的發(fā)生。

2.2.2 抗逆性改良 黃瓜已成為我國保護(hù)地栽培的第一大作物，耐低溫弱光、耐熱、耐冷、耐鹽漬化的品種選育顯得尤為重要。Ohkawa等[50]把與抗壞血酸氧化酶具有相關(guān)性的基因通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入黃瓜中，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，得到了較為抗寒的新的黃瓜轉(zhuǎn)化品系。東麗等[51]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將DREB1A基因轉(zhuǎn)入黃瓜，提高了T1代轉(zhuǎn)基因黃瓜植株的抗旱性。譚克等[52]克隆并利用花粉管通道法將與耐寒性相關(guān)的CBF1基因?qū)朦S瓜中，獲得的轉(zhuǎn)基因植株對低溫的忍受能力明顯比對照好，并且在脅迫期間幼苗含水量和可溶性糖含量均比對照高。盧淑雯等[53]將抗寒相關(guān)基因 BnCS（YD646240）通過農(nóng)桿菌 EHA105轉(zhuǎn)入黃瓜，T0種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率及胚根長均顯著高于非轉(zhuǎn)基因種子，T1植株的電解質(zhì)滲漏率和丙二醛含量也顯著低于非轉(zhuǎn)基因植株，株高、莖粗和葉面積的生長量均高于非轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)而證明了轉(zhuǎn)基因植株耐低溫能力明顯強(qiáng)于非轉(zhuǎn)基因植株。

2.3 豐產(chǎn)性改良

黃瓜和甜瓜均是重要的世界性蔬菜作物，所以提高產(chǎn)量一直是其育種的重要目標(biāo)。雌性強(qiáng)、低雌花節(jié)位、高坐果率以及產(chǎn)量均是黃瓜和甜瓜高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的基礎(chǔ)。目前，已明確黃瓜花的性別分化除了受主控基因影響外，還受多種因素的制約，其中內(nèi)源乙烯是重要影響因素之一。Shiber等[54]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將CsACS1/G 基因?qū)胍宰尤~節(jié)為外植體的雌性系黃瓜基因組中，研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株由全雌株變成了雌雄同株，該研究也為黃瓜植株的性別轉(zhuǎn)化提供了新思路。目前我國甜瓜屬作物設(shè)施栽培的主要品種普遍缺乏單性結(jié)實(shí)性，不能滿足設(shè)施生產(chǎn)的要求。白吉剛等[55]利用根癌農(nóng)桿菌把擬南芥生長素結(jié)合蛋白基因 ABP1導(dǎo)入‘津研4號黃瓜中，研究表明，該基因的導(dǎo)入明顯加強(qiáng)了黃瓜子房對生長素的感應(yīng)度，進(jìn)而提高了單性結(jié)實(shí)率，增加了黃瓜的產(chǎn)量并為黃瓜單性結(jié)實(shí)研究增添了新的材料。

2.4 生物反應(yīng)器

甜瓜屬作物作為重要的瓜類作物，農(nóng)藥殘留嚴(yán)重影響了果實(shí)的品質(zhì)。為了加快黃瓜中殘留有機(jī)磷農(nóng)藥的降解，趙杰宏等[56]選取能廣泛降解有機(jī)磷農(nóng)藥的有機(jī)磷水解酶（OPH）為表達(dá)蛋白，獲得的轉(zhuǎn)基因植株通過酶活性分析表明，轉(zhuǎn)基因黃瓜降解有機(jī)磷能力是對照組（非轉(zhuǎn)基因株組）的4.7～9.7倍，為蔬菜食品安全研究提供借鑒。吳家媛[57]等將可防治齲齒的變異鏈球菌表面蛋白A區(qū)與霍亂毒素B亞單位嵌合質(zhì)粒（PAcA-ctxB）成功轉(zhuǎn)入黃瓜，為轉(zhuǎn)基因可食防齲疫苗的進(jìn)一步研究提供了研究基礎(chǔ)。

3 甜瓜屬作物重要功能基因研究進(jìn)展

重要功能基因的發(fā)掘與克隆是基因工程育種的基礎(chǔ)，明確基因的分子功能和調(diào)控機(jī)制能為育種改良提供理論指導(dǎo)，而轉(zhuǎn)基因技術(shù)是達(dá)到上述目標(biāo)的最關(guān)鍵途徑之一。隨著黃瓜和甜瓜在基因組研究中的突破和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的蓬勃發(fā)展，大量功能基因獲得了克隆與研究。

3.1 黃瓜相關(guān)基因

3.1.1 苦味基因 苦味是降低黃瓜品質(zhì)的重要因素之一，在生產(chǎn)過程中果實(shí)苦味的問題在世界各地均有發(fā)生，造成了巨大損失[58]。早在1959年，荷蘭育種家Andeweg等[59]就已經(jīng)從美國改良長綠品種中篩選出完全無苦味的黃瓜品系，經(jīng)Balkema等[60]研究確定了苦味素或葫蘆素是黃瓜苦味的起因，但其遺傳機(jī)制比較復(fù)雜，除遺傳因素外還和環(huán)境條件有關(guān)。顧興芳等[61]的研究結(jié)果表明，在黃瓜基因組中，不同的器官中存在著不同的控制苦味基因，其中基因Bt調(diào)控果實(shí)而Bi調(diào)控營養(yǎng)器官。同時2者間也相互作用，相互影響，純合的bibi基因?qū)t基因具有隱性上位作用。同時也證實(shí)了Bi和Bi-2基因影響著營養(yǎng)器官中的苦味，而Bt和Bt-2基因影響著黃瓜果實(shí)中的苦味。馬永碩[62]克隆并使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)把可能與Bi相關(guān)的基因Csa680導(dǎo)入沒有苦味的黃瓜‘151G基因組中，研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化植株中Csa680基因的表達(dá)量顯著增加，同時轉(zhuǎn)化植株中的葫蘆素C含量也大量增加，進(jìn)一步證實(shí)了Csa680基因就是Bi基因?？刂乒麑?shí)苦味的Bt基因的相關(guān)研究較bi基因少，Shang等[63]發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄因子Bi和Bt在葉和果實(shí)中的調(diào)節(jié)通路，但目前為止尚未進(jìn)行Bt基因在黃瓜中的轉(zhuǎn)基因操作和功能驗(yàn)證。

3.1.2 果實(shí)刺瘤基因 果實(shí)是黃瓜重要經(jīng)濟(jì)器官，外觀品質(zhì)能夠決定其商品價值，而果刺、果瘤的覆蓋直接影響黃瓜的外觀品質(zhì)，進(jìn)而影響其市場價格。表皮毛普遍存在于黃瓜植株地上部分的表面，在黃瓜子房或果實(shí)上的表皮毛即為果刺[64]，黃瓜的果刺和表皮毛有著相似的形態(tài)發(fā)育[65-66]。曹辰興等[67]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃瓜的刺與瘤基因（Tu）協(xié)同作用于黃瓜果實(shí)表面性狀的表達(dá)。細(xì)胞核基因影響著表皮毛相關(guān)的表型，其中有毛（Gl）是顯性表型，無毛（gl）是隱性，而在正常情況下，黃瓜果實(shí)表面有毛均有刺，而刺瘤的出現(xiàn)可有可無。有瘤性狀為顯性基因（Tu）控制，無瘤性狀為隱性基因（tu）控制。李強(qiáng)等[68]通過遺傳分析結(jié)果表明，無毛基因（gl）對控制果瘤性狀的果瘤基因（Tu）存在隱性上位作用。楊緒勤[69]經(jīng)過對基因進(jìn)行定位得出了大致的結(jié)論，單基因Tu影響著黃瓜的果瘤表型，而Csa016861基因可能就是該基因的候選基因。同時經(jīng)過農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化法對Csa016861基因進(jìn)行了驗(yàn)證，通過對轉(zhuǎn)基因植株果實(shí)性狀的觀察，證實(shí)了該基因確實(shí)是Tu基因，同時也用試驗(yàn)說明了黃瓜果實(shí)的果刺和果瘤的形成密切相關(guān)。陳春花等[64]利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，通過在黃瓜中導(dǎo)入基因CsTTG1和CsGL2，研究了它們對表皮毛形成的影響，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因黃瓜果實(shí)表面的果刺和表皮毛明顯增多，果刺的體積也顯著增大，而商品瓜的刺瘤性狀更顯著。

3.1.3 黃瓜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)控基因 花粉管伸長時的高代謝活動需要高效的糖運(yùn)輸來支持，運(yùn)輸失敗會導(dǎo)致雄性不育。蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白現(xiàn)已被證明在花粉管發(fā)育中起重要作用[70]。Cheng等[71]利用同源性分析克隆了黃瓜上的一個單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因CsHT1，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)入黃瓜品種‘新泰密刺，并觀察到該基因在黃瓜花粉中過表達(dá)CsHT1能提高黃瓜花粉在葡萄糖或者半乳糖培養(yǎng)基上的萌發(fā)率和花粉管的長度，從而影響種子的形成。

3.1.4 黃瓜葉片基因 在擬南芥中，HAN（HANABA TARANU）主要調(diào)控花器官的發(fā)育、頂端分生組織的形態(tài)和胚胎發(fā)育，而莖尖分生組織是持續(xù)產(chǎn)生其他器官和組織的關(guān)鍵，而葉片是其主要能量來源器官，葉形直接影響光合作用的效率[72]。Ding等[73]研究了HAN在黃瓜上的功能，將HAN的同源基因CsHAN1轉(zhuǎn)入黃瓜，在轉(zhuǎn)基因植株中發(fā)現(xiàn)CsHAN1主要在莖尖分生組織和莖的連接處表達(dá)，且該基因過表達(dá)和RNAi導(dǎo)致胚胎發(fā)生后早期延緩生長并且葉緣產(chǎn)生深裂；此外還發(fā)現(xiàn)，CsHAN1基因可以通過調(diào)控WUS和STM途徑而調(diào)控莖尖分生組織發(fā)育、黃瓜頂端分生組織的發(fā)育，以及通過復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來調(diào)控黃瓜葉片的發(fā)育。這些結(jié)果不僅豐富了黃瓜基因的功能研究也為培育優(yōu)良株型的黃瓜新品種提供了理論指導(dǎo)。

3.2 甜瓜相關(guān)基因研究

甜瓜是全球10大水果之一，但甜瓜生產(chǎn)除了病蟲害危害外，果實(shí)的不耐貯運(yùn)、貨架期相對較短，在運(yùn)輸和銷售過程中伴隨著果實(shí)的成熟和軟化，損失加劇，這些均嚴(yán)重影響了甜瓜的品質(zhì)和外觀性狀，制約了甜瓜的商業(yè)化發(fā)展。

3.2.1 乙烯合成基因 甜瓜是呼吸躍變型植物，乙烯對其果實(shí)的成熟和衰老起著重要作用，也影響著果實(shí)成熟及采后貯藏性。在1996年Ayub等[74]就已經(jīng)將反義ACC氧化酶基因轉(zhuǎn)入甜瓜，產(chǎn)生了耐貯藏和品質(zhì)較好的轉(zhuǎn)基因甜瓜株系。目前己確定果肉顏色的發(fā)育為乙稀不依賴型，而果實(shí)發(fā)育過程中的果皮顏色受乙稀合成的影響，其中控制綠果肉（green flesh colour，gfc）和白果肉（white flesh colour，wfc）的基因是一對質(zhì)量性狀基因，而控制橙果肉（orange flesh colour，ofc）的為數(shù)量性狀基因[75]。高峰等[76]研究發(fā)現(xiàn)，Cm-ERF1、Cm-ERF2基因可能在甜瓜果實(shí)乙烯躍變過程中具有重要作用，而Cm-EIN2和Cm-CTR1可能在甜瓜果實(shí)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。同時也將反義ACO1基因轉(zhuǎn)入甜瓜，在可溶性固形物含量不變的情況下，獲得了乙烯含量低、貯藏期長且果實(shí)硬度不變的轉(zhuǎn)基因甜瓜株系。馬勇[77]在Hao等[45]的研究基礎(chǔ)之上對果實(shí)發(fā)育相關(guān)的4個基因家族進(jìn)行功能研究，并對CmERFII-9基因在甜瓜果實(shí)中的成熟期進(jìn)行了研究觀察，進(jìn)一步證實(shí)了該基因在甜瓜果實(shí)發(fā)育成熟過程中對ACO基因發(fā)揮正調(diào)控作用。

3.2.2 蔗糖合成基因 含糖量是衡量甜瓜品質(zhì)的主要依據(jù)之一，是影響果實(shí)品質(zhì)及風(fēng)味物質(zhì)的主要成分。蔗糖合成酶在蔗糖代謝中調(diào)控可逆反應(yīng)，聞小霞[78]克隆了甜瓜果實(shí)蔗糖合成酶基因CmSS1，并構(gòu)建了該基因的反義表達(dá)載體進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化，研究發(fā)現(xiàn)，CmSS1在甜瓜果實(shí)發(fā)育不同時期中，隨著果實(shí)發(fā)育時間的延長，CmSS1的表達(dá)量逐漸降低。蔗糖磷酸合成酶（SPS）對光合產(chǎn)物在蔗糖和淀粉之間的分配具有重要的調(diào)控作用，也可能會改變蔗糖的代謝模式，另外SPS 還參與了植物的光合作用。因此，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)的方法改變蔗糖代謝酶的活性對甜瓜品質(zhì)育種具有重要意義。田紅梅[79]研究了轉(zhuǎn)入反義SPS基因和正義SPS基因的甜瓜株系，證明了SPS活性的高低是蔗糖積累的關(guān)鍵因素和必要前提，SPS活性升高會促進(jìn)碳水化合物向蔗糖方向合成，而抑制淀粉的積累。

3.2.3 霜霉病相關(guān)基因 霜霉病是甜瓜主要病害，可造成甜瓜植株枯萎、死亡，很大程度上降低了甜瓜產(chǎn)量和品質(zhì)，嚴(yán)重制約甜瓜產(chǎn)業(yè)健康、快速發(fā)展。在國內(nèi)已知的抗霜霉病基因有Pc-1、Pc-2、Pc-3、Pc-4和Pc-5，但這些基因均沒有進(jìn)行功能驗(yàn)證。目前對霜霉病研究較多的是At2基因，它是參與植物光呼吸代謝過程中轉(zhuǎn)氨酶反應(yīng)的一種抗性酶，可直接反映轉(zhuǎn)基因甜瓜對霜霉病的抗性[80]。Taler等[81]研究發(fā)現(xiàn)At1和At2這2個都不屬于任何一種已知的抗病基因的因酶賦予植物的抗性基因，他們提出一種新的抗病機(jī)制“酶抗性”。聶祥祥[82]構(gòu)建了含霜霉病抗性基因At2的雙 T-DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化甜瓜，進(jìn)行霜霉病活力檢測，發(fā)現(xiàn)At2基因確實(shí)能夠改善甜瓜對病原菌的抗性，同時猜測對其他的病原菌也具有一定的抗性。李思怡[83]利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對甜瓜抗霜霉病基因At2進(jìn)行了研究分析，獲得了抗霜霉病的轉(zhuǎn)基因植株，提高了甜瓜對霜霉病的抵抗能力。

4 問題與展望

隨著研究的不斷深入，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在甜瓜屬作物遺傳育種和基因功能研究等多個領(lǐng)域都得到了廣泛應(yīng)用，帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益，推動了甜瓜屬生物產(chǎn)業(yè)和生物經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，但依然面臨著許多問題與挑戰(zhàn)，再生體系的基因型效應(yīng)、偏低的遺傳轉(zhuǎn)化率、轉(zhuǎn)基因安全等依舊是阻礙甜瓜屬轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展的重要問題。為解決基因工程技術(shù)在甜瓜屬作物分子遺傳育種中的瓶頸，更加準(zhǔn)確地鑒定甜瓜屬作物的優(yōu)良農(nóng)藝性狀，使轉(zhuǎn)基因技術(shù)在甜瓜屬作物中得到更為廣泛的利用，多系統(tǒng)聯(lián)合使用將成為重要途徑。

參考文獻(xiàn)

[1] ALE? LEBEDA，YIGAL COHEN.Cucurbit downy mildew （Pseudoperonospora cubensis）—biology，ecology， epidemiology，host-pathogen interaction and control[J].European Journal of Plant Pathology，2010， 129（2）：157-192.

[2] COLUCCI S J，WEHNER T C，HOLMES G J.The downy mildew epidemic of 2004 and 2005 in the Eastern United States[J]. Cucurbitaceae 2006， Asheville， North Carolina， USA， 17-21 September 2006， 2006： 403-411.

[3] PANG X，ZHOU X，WAN H，et al.QTL mapping of downy mildew resistance in an introgression line derived from interspecific hybridization between cucumber and cucumis hystrix[J].Journal of Phytopathology，2013，161（7-8）：536–543.

[4] 黃仲生.保護(hù)地黃瓜霜霉病發(fā)生與防治新技術(shù)研究[J].吉林蔬菜，1995（2）：14-15.

[5] WOLUKAU J N， ZHOU X H， LI Y， et al. Resistance to gummy stem blight in melon （Cucumis melo L.） germplasm and inheritance of resistance from plant introductions 157076，420145，and 323498[J]. Hortscience A Publication of the American Society for Horticultural Science，2007，42（2）：215-221.

[6] 錢春桃，婁群峰，陳勁楓.我國甜瓜屬蔬菜作物特異基因資源的挖掘和利用[J].中國蔬菜，2006，1（7）：30-32.

[7] HUANG S，LI R，ZHANG Z，et al.The genome of the cucumber，Cucumis sativus L.[J].Nature Genetics，2009，41（12）：1275.

[8] GARCIAMAS J，BENJAK A，SANSEVERINO W，et al.The genome of melon（Cucumis melo L.）[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2012，109（29）：11872.

[9] RAHARJO S H，HERNANDEZ M O，ZHANG Y Y，et al.Transformation of pickling cucumber with chitinase-encoding genes using Agrobacterium tumefaciens[J].Plant Cell Reports，1996，15（8）：591-6.

[10] BORDAS M，MONTESINOS C，DABAUZA M，et al.Transfer of the yeast salt tolerance gene HAL1 to Cucumis melo L. cultivars and in vitro evaluation of salt tolerance[J].Transgenic Research，1997，6（1）：41-50.

[11] 侯愛菊，朱延明，楊愛馥，等.誘導(dǎo)黃瓜直接器官發(fā)生主要影響因素的研究[J].園藝學(xué)報，2003，30（1）：101-103.

[12] 蘇紹坤，劉宏宇，秦智偉.農(nóng)桿菌介導(dǎo)iaaM基因黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006，37（3）：289-293.

[13] 肖守華，喬衛(wèi)華，張岳民，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將小麥γ-硫堇蛋白基因轉(zhuǎn)入厚皮甜瓜[J].中國蔬菜，2008，1（12）：11-14.

[14] DIRKS R，BUGGENUM M V.In vitro plant regeneration from leaf and cotyledon explants of Cucumis melo L.[J].Plant Cell Reports，1989，7（8）：626.

[15] 寧宇，李蕾，苗永美，等.乙酰丁香酮及共培養(yǎng)pH對黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響[J].中國瓜菜，2013，26（5）：6-9.

[16] 王燁，顧興芳，張圣平，等.硫辛酸對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黃瓜子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化的影響[J].華北農(nóng)學(xué)報，2012，27（b12）：51-56.

[17] 方麗，任海英，茹水江，等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，21（3）：211-214.

[18] 李建欣，李建吾，葛桂民.黃瓜子葉離體再生體系研究[J].長江蔬菜，2008（1）：44-47.

[19] 李蕾，孟永嬌，張璐， 等.黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化的研究[J].華北農(nóng)學(xué)報，2015，30（5）：115-121.

[20] 王學(xué)斌，司龍亭，孟茜，等.潮霉素濃度和農(nóng)桿菌浸泡時間對黃瓜外植體再生的影響[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2013，44（2）：143-147.

[21] 崔麗巍.木糖篩選系統(tǒng)在黃瓜轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用[D].長春：東北師范大學(xué)，2010.

[22] 劉方，王坤波，宋國立，等.花粉管通道法轉(zhuǎn)基因棉花材料的獲得[J]. 中國棉花，2008，35（8）：16.

[23] ZHOU G Y.Introduction of exogenous DNA into plants after pollination via the pollen tube pathway[M].Angiosperm Pollen and Ovules.Springer New York，1992：336-339.

[24] 哈斯阿古拉，牛一丁，張麗，等.花粉管通道法轉(zhuǎn)基因技術(shù)在甜瓜品種河套蜜瓜上的應(yīng)用[J].內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報（自然版），2007，38（4）：419-423.

[25] 張文珠，魏愛民，杜勝利，等.黃瓜農(nóng)桿菌介導(dǎo)法與花粉管通道法轉(zhuǎn)基因技術(shù)[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，18（1）：217-220.

[26] ZHANG H J，LUAN F S.Transformation of the CmACS-7 gene into melon （Cucumis melo L.） using the pollen-tube pathway[J].Genetics & Molecular Research，2016，15（3）：15038067.

[27] CHEE P P，SLIGHTOM J L.Transformation of cucumber tissues by microprojectile bombardment：identification of plants containing functional and non-functional transferred genes[J].Gene，1992，118（2）：255-260.

[28] KODAMA H，IRIFUNE K， KAMADA H，et al.Transgenic roots produced by introducing Ri-rol genes into cucumber cotyledons by particle bombardment[J].Transgenic Research，1993，2（2）：147-152.

[29] GONSALVES C，XUE B，YEPES M，et al.Transferring cucumber mosaic virus-white leaf strain coat protein gene into Cucumis melo L. and evaluating transgenic plants for protection against infections[J].Journal of the American Society for Horticultural Science American Society for Horticultural Science，1994，119（2）：345-355.

[30] 徐冉，湯雪燕，繆旻珉，等.黃瓜酸性α-半乳糖苷酶Ⅰ的亞細(xì)胞定位[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（6）：208-210.

[31] 俞婷，許學(xué)文，施陽，等.基于SNP標(biāo)記的黃瓜抗白粉病染色體片段代換系鑒定及抗病基因功能分析[C]//中國園藝學(xué)會黃瓜分會年會，2015.

[32] BASKARAN P，SO?S V，BAL?ZS E，et al.Shoot apical meristem injection：A novel and efficient method to obtain transformed cucumber plants[J].South African Journal of Botany，2016，103：210-215.

[33] 韓偉，劉娥娥，王亞琴，等.瓜類蔬菜轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展[J].中國蔬菜，2010（4）：8-13.

[34] 肖光輝，鄭素秋.外源DNA導(dǎo)入創(chuàng)造抗枯萎病西瓜種質(zhì)資源[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），1999，25（6）：453-457.

[35] 肖小君，王輝，齊澤民，等.轉(zhuǎn)基因技術(shù)及其在水稻育種中的研究進(jìn)展[J].井岡山大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2011，32（5）：60-65.

[36] 葉興國，陳明，杜麗璞，等.小麥轉(zhuǎn)基因方法及其評述[J].遺傳，2011，33（5）：422-430.

[37] 陳英，曹毅，蔣彥，等.轉(zhuǎn)基因玉米的遺傳轉(zhuǎn)化方法研究[J].草業(yè)與畜牧，2000（1）：51-55.

[38] 姚祝平，程遠(yuǎn)，萬紅建，等.CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在植物基因工程育種中的應(yīng)用[J].分子植物育種，2017（7）：2647-2655.

[39] 劉華威，羅來鑫，朱春雨，等.黃瓜綠斑駁花葉病毒病防治研究進(jìn)展[J].植物保護(hù)，2016，42（6）：29-37.

[40] 王雪，李冠.CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除甜瓜ACC合成酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建[J].北方園藝，2017（12）：114-118.

[41] 陳秀蕙，何煥新，曾輝.菠蘿DNA導(dǎo)入黃瓜的初步研究[J].海南大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），1998（1）：62-68.

[42] SZWACKA M，KRZYMOWSKA M，MALEPSZY S.Thaumatin expression in transgenic cucumber plants[M].Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21st Century.Springer Netherlands，1999：609-612.

[43] 李曉榮.新疆哈密瓜轉(zhuǎn)ACC脫氨酶基因的研究[D].烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002.

[44] 樊繼德，何啟偉，王秀峰，等.甜瓜反義酸性轉(zhuǎn)化酶基因?qū)μ鸸系倪z傳轉(zhuǎn)化[J].園藝學(xué)報，2007，34（3）：677-682.

[45] HAO J，NIU Y，YANG B，et al.Transformation of a marker-free and vector-free antisense ACC oxidase gene cassette into melon via the pollen-tube pathway[J].Biotechnology Letters，2011，33（1）：55-61.

[46] 鄧立平，郭亞華，楊曉輝.外源基因?qū)朦S瓜獲得突變新品系[J].遺傳，1995，17（2）：33.

[47] 何鐵海，應(yīng)成波，錢劍銳，等.抗CMV病毒外殼蛋白CP基因?qū)朦S瓜的研究[J].河南科技學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），2001，29（3）：27-28.

[48] GALON A，WOLF D，ANTIGNUS Y，et al.Transgenic cucumbers harboring the 54-kDa putative gene of cucumber fruit mottle mosaic tobamovirus are highly resistant to viral infection and protect non-transgenic scions from soil infection[J].Transgenic Research，2005，14（1）：81-93.

[49] 田花麗.農(nóng)桿菌介導(dǎo)銀杏抗菌蛋白基因Gk-2轉(zhuǎn)化黃瓜抗病性研究[D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2010.

[50] OHKAWA J，OHYA T，ITO T，et al.Structure of the genomic DNA encoding cucumber ascorbate oxidase and its expression in transgenic plants[J].Plant Cell Reports，1994，13（9）：481-488.

[51] 東麗，李杰，朱延明.抗真菌、抗?jié)B透脅迫基因多價植物表達(dá)載體構(gòu)建及對黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化的研究[J].農(nóng)業(yè)科技通訊，2008（3）：37-41.

[52] 譚克，趙福順，吳慧杰，等.冷誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄因子CBF1轉(zhuǎn)入黃瓜的研究[J].北方園藝，2015（9）：79-82.

[53] 盧淑雯，劉文萍，李柱剛，等.黃瓜耐低溫基因轉(zhuǎn)化后代的生物學(xué)鑒定[J].中國蔬菜，2010（10）：16-19.

[54] SHIBER A，GAUR R K，RIMONKNOPF R，et al.The origin and mode of function of the female locus in cucumber[C]//Ixth Eucarpia Meeting on Genetics and Breeding of Cucurbitaceae，Avignon，2008：263-272.

[55] 白吉剛，王秀娟，尹謙遜，等.生長素結(jié)合蛋白基因轉(zhuǎn)化黃瓜的研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，37（2）：263-267.

[56] 趙杰宏，韓潔，趙德剛.轉(zhuǎn)基因表達(dá)有機(jī)磷水解酶（OPH）提高黃瓜降解蠅毒磷能力的初步研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010，26（1）：182-186.

[57] 吳家媛，劉建國，馬欣榮，等.變異鏈球菌表面蛋白A區(qū)與霍亂毒素B亞單位嵌合基因轉(zhuǎn)基因黃瓜植株的獲得及鑒定[J].口腔醫(yī)學(xué)研究，2016（9）：902-906.

[58] 張圣平，苗晗，程周超，等.黃瓜果實(shí)苦味（Bt）基因的插入缺失（Indel）標(biāo)記[J] .農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2011，19（4）：649-653.

[59] ANDEWEG J M，BRUYN J W D.Breeding of non-bitter cucumbers[J].Euphytica，1959，8（1）：13-20.

[60] BALKEMA-BOOMSTRA A G，ZIJLSTRA S，VERSTAPPEN F W，et al.Role of cucurbitacin C in resistance to spider mite（Tetranychus urticae）in cucumber（Cucumis sativus L.）[J].Journal of Chemical Ecology，2003，29（1）：225-235.

[61] 顧興芳，張圣平，國艷梅，等.黃瓜苦味遺傳分析[J].園藝學(xué)報，2004，31（5）：613-616.

[62] 馬永碩.黃瓜營養(yǎng)體苦味基因Bi的克隆及功能解析[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[63] SHANG Y，MA Y，ZHOU Y，et al.Biosynthesis，regulation，and domestication of bitterness in cucumber[J].Science，2014，346（6213）：1084-1088.

[64] 陳春花.黃瓜表皮毛發(fā)育及其相關(guān)基因CsTTG1和CsGL2的功能分析[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[65] 關(guān)媛.黃瓜果刺形成相關(guān)基因的定位與克隆[D].上海：上海交通大學(xué)，2008.

[66] 張馳.黃瓜Gl基因連鎖的SRAP分子標(biāo)記[D].上海：上海交通大學(xué)，2009.

[67] 曹辰興，張松，郭紅蕓.黃瓜莖葉無毛性狀與果實(shí)瘤刺性狀的遺傳關(guān)系[J]. 園藝學(xué)報，2001，28（6）：565-566.

[68] 李強(qiáng).黃瓜表皮毛相關(guān)基因的定位、同源克隆與功能研究[D].山東泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[69] 楊緒勤.黃瓜果瘤和果實(shí)無光澤性狀基因的定位與功能分析[D].上海：上海交通大學(xué)，2014.

[70] GOETE M，GODT D E，GUIVARC'H A，et al.Induction of male sterility in plants by metabolic engineering of the carbohydrate supply[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2001，98（11）：6522-6527.

[71] CHENG J，WANG Z，YAO F，et al.Down-regulating CsHT1，a cucumber pollen-specific hexose transporter，inhibits pollen germination，tube growth，and seed development[J].Plant Physiology，2015，168（2）：635-47.

[72] TSUKAYA H.Mechanism of leaf-shape determination[J].Annual Review of Plant Biology，2006，57（1）：477.

[73] DING L，YAN S，JIANG L，et al.HANABA TARANU regulates the shoot apical meristem and leaf development in cucumber（Cucumis sativus L.）[J].Journal of Experimental Botany，2015，66（22）：7075-7087.

[74] AYUB R，GUIS M，AMOR M B，et al.Expression of ACC oxidase antisense gene inhibits ripening of cantaloupe melon fruits[J].Nature Biotechnology，1996，14（7）：862-866.

[75] MONFORTE A J，OLIVER M，GONZALO M J，et al.Identification of quantitative trait loci involved in fruit quality traits in melon（Cucumis melo L.）[J].Theoretical & Applied Genetics，2004，108（4）：750-758.

[76] 高峰，怡榮，郝金鳳，等.甜瓜乙烯應(yīng)答因子基因在果實(shí)發(fā)育成熟過程中的表達(dá)特性[J].西北植物學(xué)報，2012，32（5）：886-889.

[77] 馬勇. 甜瓜果實(shí)發(fā)育相關(guān)四個基因家族的全基因組分析及CmERFII-9基因的功能研究[D].內(nèi)蒙古呼和浩特：內(nèi)蒙古大學(xué)，2015.

[78] 聞小霞.甜瓜果實(shí)蔗糖合成酶基因（SS）的克隆、表達(dá)分析及遺傳轉(zhuǎn)化[D].山東泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[79] 田紅梅.甜瓜蔗糖磷酸合成酶基因的功能鑒定與分析[D].山東泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[80] GALPERIN M，PATLIS L，OVADIA A，et al.A melon genotype with superior competence for regeneration and transformation[J].Plant Breeding，2003，122（1）：66-69.

[81] Taler D，Galperin M，Benjamin I，et al.Plant eR genes that encode photorespiratory enzymes confer resistance against disease[J].Plant Cell，2004，16（1）：172-184.

[82] 聶祥祥.甜瓜抗霜霉病無選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化和功能驗(yàn)證[D]. 烏魯木齊：新疆大學(xué)，2014.

[83] 李思怡. 甜瓜抗霜霉病基因AT2功能驗(yàn)證[D]. 烏魯木齊：新疆大學(xué)，2016.