豬睪丸(ST)細(xì)胞系作為豬瘟活疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)的研究

任向陽(yáng) ， 吳文福 ， 岑小清 ， 劉秋燕 ， 游啟有 ， 賴(lài)月輝

(1.廣東永順生物制藥股份有限公司 ， 廣東廣州510623 ； 2.廣州出入境檢驗(yàn)檢疫局 ， 廣東廣州510623)

豬瘟是由豬瘟病毒(CSFV)引起的豬的一種危害嚴(yán)重的烈性傳染病，其特征為小血管的變性導(dǎo)致組織器官的多發(fā)性出血、壞死和梗死[1]。豬瘟嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)并造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。疫苗免疫接種是我國(guó)預(yù)防控制豬瘟的主要措施[2-3]。采用牛睪丸原代細(xì)胞生產(chǎn)的豬瘟活疫苗對(duì)當(dāng)時(shí)我國(guó)的豬瘟防控起到了重要作用。但因受到牛睪丸來(lái)源不均一、生產(chǎn)工藝不穩(wěn)定等因素影響，導(dǎo)致生產(chǎn)的豬瘟活疫苗批間差異大、質(zhì)量不穩(wěn)定，且存在外源病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)[4]。采用豬睪丸(ST)傳代細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟活疫苗在生產(chǎn)工藝、疫苗純凈性、病毒含量和質(zhì)量穩(wěn)定性等方面取得了顯著突破[4-5]。本試驗(yàn)對(duì)豬睪丸(ST)細(xì)胞作為豬瘟活疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)的可行性進(jìn)行了探討。試驗(yàn)方法和結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料

1.1 試驗(yàn)細(xì)胞 豬睪丸(ST)細(xì)胞系，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，廣東永順生物制藥股份有限公司傳代、鑒定和保存。

1.2 對(duì)照細(xì)胞 陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞：鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6(18)。陰性對(duì)照細(xì)胞：鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3。

1.3 試驗(yàn)用仔豬 來(lái)源于廣東永順生物制藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)自繁自養(yǎng)的CSFV、PRV、PRRSV、PCV2、PPV抗原陰性且未接種過(guò)CSF疫苗的二元雜交仔豬。經(jīng)豬瘟中和試驗(yàn)方法檢測(cè)，選擇豬瘟中和抗體陰性的25～30日齡健康易感仔豬。

1.4 攻毒用強(qiáng)毒 豬瘟強(qiáng)毒石門(mén)系血毒，由廣東永順生物制藥股份有限公司制備、鑒定和保存。

2 方法

2.1 ST細(xì)胞系的培養(yǎng) 取ST細(xì)胞經(jīng)胰酶-EDTA細(xì)胞消化液消化傳代，以MEM生長(zhǎng)液或維持液置36 ℃～37 ℃培養(yǎng)，形成良好單層時(shí)，用于繼續(xù)傳代或接種病毒。

2.2 ST細(xì)胞系的檢驗(yàn)

2.2.1 純凈性檢驗(yàn) 將ST基礎(chǔ)細(xì)胞庫(kù)細(xì)胞復(fù)蘇，傳代至F3作為待檢細(xì)胞，記作ST(F3)細(xì)胞。復(fù)蘇ST工作細(xì)胞庫(kù)細(xì)胞，連續(xù)傳代至F5、F10、F15、F20、F25和F30作為待檢細(xì)胞，分別記作ST(F5)、ST(F10)、ST(F15)、ST(F20)、ST(F25)和ST(F30)細(xì)胞。觀察不同代次待檢細(xì)胞的生長(zhǎng)特性，并按現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)獸藥典》對(duì)待檢細(xì)胞進(jìn)行細(xì)菌、真菌、支原體和外源病毒檢驗(yàn)[6]。

2.2.2 致瘤性試驗(yàn) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ST(F3)、ST(F5)、ST(F10)、ST(F15)、ST(F20)、ST(F25)和ST(F30)待檢細(xì)胞和NIH3T3陰性對(duì)照細(xì)胞分別用PBS稀釋成5×107/mL細(xì)胞懸液，每組分別接種裸鼠10只，每只背部皮下注射0.2 mL(含107個(gè)細(xì)胞)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C6陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞用PBS稀釋成5×106/mL的細(xì)胞懸液，接種裸鼠10只，每只背部皮下注射0.2 mL(含106個(gè)細(xì)胞)。連續(xù)觀察14日，檢查有無(wú)結(jié)節(jié)或腫瘤形成。如果有結(jié)節(jié)或可疑病灶，繼續(xù)觀察1周，然后剖檢，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。對(duì)未發(fā)生結(jié)節(jié)的動(dòng)物，取其中半數(shù)裸鼠觀察3周剖檢，對(duì)另外半數(shù)裸鼠觀察12周后剖檢，觀察各淋巴結(jié)和內(nèi)臟器官中有無(wú)結(jié)節(jié)形成，對(duì)疑似者進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。斷頸處死裸鼠后，立即取瘤組織，經(jīng)10% 福爾馬林固定，制成石蠟切片。按照常規(guī)方法進(jìn)行蘇木素-伊紅染色并觀察結(jié)果。

2.2.3 胞核學(xué)檢驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ST(F3)、ST(F10)、ST(F20)和ST(F30)細(xì)胞分別加入Colchicine 0.2 μg/mL培養(yǎng)液，37 ℃作用3～7 h。D-Hank′s 洗一次，0.25% Trypsin消化，D- Hank′s洗一次，0.075M KCl 37 ℃低滲15 min，甲醇：乙酸(3∶1)固定3～4次，離心后少量固定液懸浮細(xì)胞，滴片，60 ℃干燥過(guò)夜，Giemsa染色10 min，水洗并空氣干燥，二甲苯透明，封片。每組細(xì)胞分別觀察50個(gè)處于有絲分裂中期細(xì)胞的染色體數(shù)。

2.3 ST細(xì)胞系繁殖豬瘟病毒的增殖試驗(yàn) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ST(F5)、ST(F10)、ST(F15)、ST(F20)、ST(F25)和ST(F30)細(xì)胞，按3%接毒量分別接種同一批豬瘟毒種，接毒后5日作第一次收獲換液，之后每隔4日收獲換液1次。取一收至五收毒液分別用家兔測(cè)定其效價(jià)。將毒液用滅菌生理鹽水作5×105倍稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度分別接種家兔2只，每只耳靜脈注射1.0 mL。接種后家兔體溫反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)與結(jié)果判定參考現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)獸藥典》。

2.4 ST細(xì)胞系繁殖的豬瘟病毒的免疫原性試驗(yàn) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ST(F5)、ST(F15)、ST(F20)和ST(F30)細(xì)胞，按3%接毒量分別接種同一批豬瘟種毒，接毒后5日作第一次收獲換液，之后每隔4日收獲換液1次。將一收至五收的混合毒液用滅菌生理鹽水作2×105倍稀釋?zhuān)謩e接種無(wú)豬瘟中和抗體的25～30日齡健康易感仔豬5頭，每頭耳后頸部肌肉注射1.0 mL。接種14日后，連同5頭條件相同的非免疫對(duì)照仔豬分別攻擊豬瘟強(qiáng)毒，每頭頸部肌肉注射豬瘟石門(mén)系血毒1.0 ml/頭(含105MLD)。攻毒后每天觀察臨床癥狀，每天上、下午各測(cè)體溫一次，連續(xù)觀察16天，并統(tǒng)計(jì)分析攻毒結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

3.1 生長(zhǎng)特性觀察及純凈性檢驗(yàn)結(jié)果 ST(F3)、ST(F5)、ST(F10)、ST(F15)、ST(F20)、ST(F25)和ST(F30)細(xì)胞在pH值7.0～7.2的MEM營(yíng)養(yǎng)液中，置37 ℃，含5% CO2條件下培養(yǎng)24～72 h，均可長(zhǎng)成良好單層。經(jīng)顯微鏡觀察，上述各代次ST細(xì)胞長(zhǎng)成良好單層時(shí)，均附著貼壁生長(zhǎng)，折光性強(qiáng)，形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞透明度大，沒(méi)有空泡和融合細(xì)胞。上述各代次細(xì)胞經(jīng)檢驗(yàn)均沒(méi)有細(xì)菌、真菌、支原體和外源病毒污染。

3.2 致瘤性試驗(yàn)結(jié)果 ST(F3)、ST(F5)、ST(F10)、ST(F15)、ST(F20)、ST(F25)、ST(F30)待檢細(xì)胞和NIH3T3陰性對(duì)照細(xì)胞接種裸鼠觀察21日均未出現(xiàn)結(jié)節(jié)或腫瘤形成(結(jié)果見(jiàn)表1)；取其中一半裸鼠于細(xì)胞接種后3周進(jìn)行剖檢觀察，各淋巴結(jié)和器官均未出現(xiàn)結(jié)節(jié)或腫瘤形成；取另外一半裸鼠于細(xì)胞接種后12周進(jìn)行剖檢觀察，各個(gè)淋巴結(jié)和器官均未發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)或腫瘤的形成，也無(wú)移植瘤形成。而C6細(xì)胞接種的10只裸鼠，在接種2周后在其頸背皮下均可以觀察到黃豆粒大小的腫瘤，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，腫瘤逐漸變大。取該瘤組織觀察，可見(jiàn)瘤組織質(zhì)韌、切面呈灰白色肉樣。將瘤組織經(jīng)福爾馬林固定、制成石蠟切片進(jìn)行H.E.染色后鏡檢，可見(jiàn)瘤組織內(nèi)血管豐富，瘤細(xì)胞呈梭形，排列紊亂，核分裂旺盛，伴有異型核及病理性核分裂。

表1 各組細(xì)胞致瘤性試驗(yàn)結(jié)果

3.3 胞核學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)試驗(yàn)觀察，在基礎(chǔ)細(xì)胞庫(kù)中存在的染色體標(biāo)志，在ST(F10)、ST(F20)和ST(F30)細(xì)胞中均找到，ST(F10)、ST(F20)和ST(F30)細(xì)胞中的染色體模式數(shù)均未高于ST(F3)的15%(結(jié)果見(jiàn)表2)。上述結(jié)果符合生產(chǎn)用細(xì)胞系胞核學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果。

表2 不同代次ST細(xì)胞的胞核學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果

3.4 ST細(xì)胞系繁殖豬瘟病毒的增殖試驗(yàn)結(jié)果 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ST(F5)、ST(F10)、ST(F15)、ST(F20)、ST(F25)和ST(F30)細(xì)胞，按3%接毒量分別接種同一批豬瘟種毒，上述每個(gè)代次ST細(xì)胞繁殖的一收至五收細(xì)胞毒液效價(jià)均可達(dá)到5×105RID/mL(結(jié)果見(jiàn)表3)。

3.5 ST細(xì)胞系繁殖的豬瘟病毒的免疫原性試驗(yàn)結(jié)果 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ST(F5)、ST(F15)、ST(F20)和ST(F30)細(xì)胞為基質(zhì)制備的豬瘟病毒分別接種無(wú)豬瘟中和抗體的健康易感豬5頭，接種后未見(jiàn)任何不良反應(yīng)，接種部位未出現(xiàn)腫塊，免疫豬對(duì)豬瘟強(qiáng)毒的保護(hù)率均為100%(5/5)，免疫豬的精神、食欲、體溫均無(wú)異常(結(jié)果見(jiàn)表4)。對(duì)照豬發(fā)病率100%(5/5)，均呈現(xiàn)典型的豬瘟臨床癥狀，且有4頭豬死亡，剖檢均可見(jiàn)豬瘟特征性病變。

表3 不同代次ST細(xì)胞繁殖豬瘟病毒的增殖試驗(yàn)結(jié)果

表4 不同代次ST細(xì)胞繁殖的豬瘟病毒的免疫原性試驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論

4.1 生物制品使用細(xì)胞基質(zhì)的安全性一直是WHO關(guān)心的問(wèn)題[7]。采用傳代細(xì)胞系生產(chǎn)豬瘟活疫苗，應(yīng)更加注重其傳代穩(wěn)定性和安全性。豬睪丸(ST)細(xì)胞系經(jīng)過(guò)嚴(yán)格而全面的鑒定，并建立了基礎(chǔ)細(xì)胞庫(kù)和工作細(xì)胞庫(kù)，安全純凈。 相對(duì)于采用牛睪丸原代細(xì)胞培養(yǎng)豬瘟病毒，減少了牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒(BVD/MDV)等外源因子污染生產(chǎn)基質(zhì)的可能。豬瘟兔化弱毒在ST細(xì)胞經(jīng)過(guò)反復(fù)繁殖馴化試驗(yàn)，已研究出最適培養(yǎng)系統(tǒng)、培養(yǎng)工藝，確定了培養(yǎng)基的要求、細(xì)胞接毒劑量、收獲時(shí)間和收獲次數(shù)等技術(shù)參數(shù)。豬瘟病毒已適應(yīng)于在ST細(xì)胞上繁殖。

4.2 ST細(xì)胞系在傳代過(guò)程中形態(tài)良好，分裂能力強(qiáng)，無(wú)致瘤性且染色體遺傳穩(wěn)定。取不同代次的ST細(xì)胞繁殖豬瘟病毒液并測(cè)定其毒液效價(jià)；取不同代次的ST細(xì)胞繁殖的豬瘟病毒分別對(duì)豬進(jìn)行免疫攻毒并測(cè)定其免疫原性。結(jié)果表明，將ST工作細(xì)胞傳至第30代，其仍能良好地表達(dá)豬瘟病毒，產(chǎn)毒穩(wěn)定，病毒滴度高，連續(xù)收毒，病毒產(chǎn)量高，且其所表達(dá)的豬瘟病毒仍保持良好的免疫原性。上述結(jié)果表明，豬睪丸(ST)細(xì)胞系傳代穩(wěn)定且安全，利用其制備的豬瘟病毒效價(jià)高且具有良好的免疫原性，符合豬瘟活疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)的要求。

4.3 ST細(xì)胞系在傳代過(guò)程中具有良好的生物學(xué)穩(wěn)定性和純凈性，且以ST細(xì)胞系為生產(chǎn)基質(zhì)繁殖的豬瘟病毒效價(jià)高并具有良好的免疫原性，為生產(chǎn)安全高效的豬瘟活疫苗提供了新的技術(shù)支撐。采用ST細(xì)胞系生產(chǎn)豬瘟活疫苗，生產(chǎn)效率高，生產(chǎn)工藝穩(wěn)定；疫苗病毒含量明顯提高，批間差異小，質(zhì)量可控；疫苗安全性好，大大減少了免疫接種的應(yīng)激反應(yīng)；疫苗免疫效力好，可以減少母源抗體和其他病毒的混合感染對(duì)豬瘟活疫苗的免疫干擾作用；疫苗免疫效果確實(shí)，高水平的細(xì)胞免疫和體液免疫水平可以防止免疫豬的持續(xù)帶毒，使豬瘟從源頭得到控制[8-10]。